ASTM A790 2507/2205 1.4462 / 1.4410 Feadán táthaithe déphléacsacha do chomhpháirt cheimiceach an tionscail cheimiceáin, eascraíonn cobhsaíocht mhéadaithe na n -alt spliced ​​agus laghdaigh easnamh cealla suaitheantas neodrach cranial.

Go raibh maith agat as cuairt a thabhairt ar Nature.com.Tá tú ag baint úsáide as leagan brabhsálaí a bhfuil tacaíocht CSS teoranta aige.Chun an taithí is fearr a fháil, molaimid duit brabhsálaí nuashonraithe a úsáid (nó Mód Comhoiriúnachta a dhíchumasú in Internet Explorer).Ina theannta sin, chun tacaíocht leanúnach a chinntiú, taispeánann muid an suíomh gan stíleanna agus JavaScript.

ASTM A790 2507 /2205 1.4462 / 1.4410 Feadán Táthaithe Duplex do Thionscal Ceimiceach

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.Is déantúsóir ceannródaíoch é atá speisialaithe i bpíopaí gan uaim cruach dhosmálta, feadáin gheal, feadánra gan uaim.D'fhonn custaiméirí a éascú, tá píopaí agus feadáin táthaithe againn freisin.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.tá an trealamh táirgthe agus tástála is airde aige.Is féidir linn do riachtanas a shásamh go hiomlán.De réir Standard an -docht, bíonn caoinfhulaingt OD agus WT ceart i gcónaí ag feadáin a tháirgeann muid.Tá an rialú lamháltais ag teacht go hiomlán le caighdeáin a tháirgeadh.Bíonn ár dtáirgí sásta i gcónaí le custaiméirí.Cheannaigh custaiméirí ár dtáirgí a chruthaigh níos mó brabús.
a) OD (trastomhas seachtrach): 3.18mm go 101.6mm
b) wt (tiús balla): 0.5mm go 20mm
c) Fad: de réir riachtanas an chustaiméara
d) Caighdeáin: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 srl
e) Modh Próisis: ERW, EFW srl

Sleamhnáin a thaispeánann trí alt in aghaidh an tsleamhnáin.Bain úsáid as na cnaipí cúil agus seo chugainn chun bogadh tríd na sleamhnáin, nó na cnaipí rialtóra sleamhnáin ag an deireadh chun bogadh trí gach sleamhnán.
Sleamhnaíonn na cealla suaithinse néarach (CNCC) na folds néarach suthacha agus aistríonn siad go dtí na háirsí cógaisíochta, a fhoirmíonn an chuid is mó de na struchtúir lárnacha.Tá ról tábhachtach ag mífheidhm CNCC i etiology de scoilt orofacial, anchuma comhchoiteann ó bhroinn.Fuarthas sócháin specc1l heitrisigeach in othair a bhfuil scoilteanna neamhghnácha agus siondrómacha acu.Anseo, tugaimid tuairisc ar dhathú feabhsaithe na gcomhpháirteanna greamaitheacha canónacha (AJ), β-catenin agus E-cadherin i gcealla cnagála spec1L saothraithe, agus léiríonn micreagraif leictreon idirleathadh apical-basal AJ.Chun ról Specc1L a thuiscint i morphogenesis craniofacial, chruthaíomar samhail luiche easnamhach spec1L.Is iad na mutants homaighnéasacha dúnadh feadán néarach marfach agus taispeántais agus lamination CNCC.Méadaítear smálú próitéine AJ i bhfillteáin néarach mutant.Tá an fabht AJ seo ag teacht le fabht i ndíothú CNCC, a éilíonn díscaoileadh AJ.Ina theannta sin, tá comharthaíocht PI3K-AKT laghdaithe ag Mutants Specc11 agus méadaithe apoptosis.In vitro, bhí toirmeasc éadrom ar chomharthaíocht PI3K-AKT i gcealla de chineál fiáin leordhóthanach chun athruithe AJ a spreagadh.Rud atá tábhachtach, is féidir athruithe AJ a spreagann cnagadh specc1l a aisiompú trí chonair PI3K-AKT a ghníomhachtú.Le chéile, tugann na sonraí seo le fios go bhfuil gá le Specc1L, mar rialtóir núíosach ar chomharthaíocht PI3K-AKT agus AJ Biology, le haghaidh dúnadh feadán néarach agus srathú CNCC.
Déanann cealla suaitheantas néarach cranial (CNCCanna) logánú ar an neuroectoderm droma agus dícheangail ó neuroepithelium na bhfillte néarach atá ag forbairt trí phróiseas a bhaineann leis an trasdul epithelial-mesenchymal (EMT) 1,2,3.Cuireann CNCCanna epithelial permigrating isteach ar acomhail idircheallacha agus éiríonn siad ag aistriú CNCCanna mesenchymal a líonann an chéad agus an dara áirsí pharyngeal agus a chruthaíonn an chuid is mó den chartilage craniofacial.Dá bhrí sin, is minic a chuirtear isteach ar ghéinte a rialaíonn feidhm CNCC in etiology na n -aimhrialtachtaí ó bhroinn chraicneach amhail cleachtaí orofacial, a théann i bhfeidhm go coitianta ar 1/800 breith sna Stáit Aontaithe amháin.Ceann de na neamhfhoirmithe ó bhroinn8.
Tá dí -dhíláithriú an CNCC ag teacht le dúnadh an fheadáin néarógach idir 8.5 agus 9.5 lá d'fhorbairt suthach i lucha.Taispeánann mutants de roinnt géinte a bhaineann le cleft-luch a bhaineann le locht feadán néarach, lena n-áirítear IRF69,10, GHRL310, CFL111, agus PDGFRα12.Mar sin féin, is féidir na próisis a bhaineann le dúnadh feadán néarach agus srathú CNCC a mheas neamhspleách, mar go dtaispeánann an luch mutant splotch (PAX3) lochtanna i ndúnadh feadán néarach gan aon éifeacht ar shrathú nó ar imirce CNCC 13,14.Cuideoidh samhlacha breise luiche le lochtanna i ndioscadh CNCC agus dúnadh feadán néarach le bunús móilíneach an dá phróiseas seo a shainiú.
Éilíonn aonrú CNCC ó chealla neuroepithelial go ndíscaoilfear acomhail ghreamaitheacha (AJanna), atá comhdhéanta de choimpléisc próitéine ina bhfuil, i measc nithe eile, E-cadherin, β-catenin, α-e-catenin, agus α-actinin a bhaineann le filiméid actin 2 . Staidéar ró-dhírithe Léirigh E-cadherin i bhfillteán néarach laghdú nó moill ar dhíláithriú CNCC.Os a choinne sin, bíonn srathú luath15,16 mar thoradh ar chosc E-cadherin15,16.Is fachtóirí trascríobh iad go leor de na tosca a dhéanann idirghabháil EMT le linn srathú CNCC (AP2α, ID2, FOXD3, Seilide, Twist, Sox10) agus maitrís athmhúnlaithe eisilteach (ECM) amhail metalloproteinases maitríse (MMPanna), ach tá CNCCS ina ndéantóirí cytoskeletal díreach AJ AJ nach bhfuil ar eolas fós.Tá sé ar eolas ag an gcosán PI3K-AKT leibhéil E-cadherin a fhritháireamh, go príomha ó thaighde ailse17.Léirigh staidéir a rinneadh le déanaí go dtiocfaidh neamhghnácha craniofacial, lena n-áirítear lochtanna feadán cleft agus lochtanna feadáin néarach12 mar thoradh ar chailliúint comharthaíochta PI3K-AKT PDGFα-bhunaithe i lucha.Mar sin féin, níl an gaol idir an cosán PI3K-AKT agus cobhsaíocht AJ ar shrathú CNCC soiléir.
D'aithníomar roimhe seo Specc1L mar an chéad ghéin mutant i mbeirt le scoilt dhian a shíneann ón mbéal go dtí an tsúil, ar a dtugtar scoilt oblique (OBFC) nó Tessier IV18 scoilt.Sainaithníodh sócháin Specc1L in dhá theaghlach ilghnéitheacha a bhfuil an siondróm Opitz G/BBB autosomal ceannasach acu (OMIM #145410), inar thaispeáin daoine aonair a raibh tionchar orthu hipeardistance agus liopa scoilte/carball .Tá níos mó ná leath de na cásanna de shiondróm Opitz G/BBB X-nasctha (OMIM #300000) agus is iad sócháin sa ghéin MID1 is cúis leo, a ionchorpraíonn próitéin 22 den chnámh cille a bhaineann le microtubule.Déanaimid hipitéisiú go bhféadfadh specc1l, próitéin a bhaineann le microtubules agus an cíteascóp actin, comharthaíocht a theastaíonn le haghaidh athmhúnlú cytoskeleton actin le linn greamaitheacht cille agus imirce 18 a idirghabháil.Trí staidéir in vitro agus in vivo, déanaimid cur síos anois ar Specc1l mar rialtóir núíosach ar chobhsaíocht AJ trí chomharthaíocht PI3K-AKT.Ag an leibhéal ceallach, tháinig laghdú ar leibhéal an phróitéin uile-AKT mar thoradh ar easnamh specc1L agus méadú ar scaipeadh apical-basal AJ, a díothaíodh trí ghníomhachtú ceimiceach an chonair Akt a dhíchur.In vivo, léiríonn suthanna spec11-easnamhach dúnadh feadán néarach lagaithe agus dioscadh CNCC laghdaithe.Dá bhrí sin, tá feidhmeanna specc1L i gcomharthaíocht ghreamaitheachta cille an-rialaithe-bhunaithe ag teastáil le haghaidh gnáthfheidhm CNCC le linn morphogenesis aghaidhe.
Chun ról specc1L a thréithriú ag an leibhéal ceallach, d'úsáideamar an líne chill Osteosarcoma cobhsaí a ndearnadh cur síos air roimhe seo U2OS easnamhach i Specc1l18.Bhí laghdú measartha (60-70%) ag na cealla cobhsaí U2OS seo le cnagadh Specc1L (KD) ar leibhéil na n -athscríbhinní agus na bpróitéiní spec1L, mar aon le lochtanna ar imirce agus atheagrú an chíteascáin actin 18. I gcodarsnacht, laghdú neamhbhuan trom i dtionscnamh tromchúiseach i dtréimhse chnámharlaigh 18. Taispeánadh go bhfuil lochtanna mitotic mar thoradh ar Specc1l 23.Ar thréithriú breise, fuaireamar amach gur athraigh ár gcealla cobhsaí Specc1L-KD moirfeolaíocht ag leibhéal an-ard (Figiúr 1).D'fhéach cealla rialaithe aonair agus cealla KD ag cumar íseal (Figiúr 1a, d).24 uair an chloig tar éis comhleá, choinnigh cealla rialaithe a gcruth ciúbóideach (Fíor 1b, E), agus cealla specc1l-kd fadaithe (Fíor 1C, F).Gabhadh méid an athraithe seo i gcruth na gceall trí íomháú beo in vivo de chealla rialaithe agus de chealla KD (Scannán 1).Chun ról Specc1L a chinneadh i gcealla cumar, scrúdaíomar a léiriú ar dtús.Fuaireamar amach gur mhéadaigh leibhéil próitéine Specc1L ar chomhleá (Figiúr 1G), ach níor mhéadaigh leibhéil athscríbhinne Specc1L (Figiúr 1H).Ina theannta sin, de réir mar a mhéadaigh dlús na gcillíní, carnadh próitéin specc1L ag teorainneacha idircheallacha (Fíor 2A-E), le patrún ag forluí leis an β-catenin a bhaineann le membrane (Fíor 2A'-E ').Mar gheall ar chomhcheangal Specc1L leis an Actin Cytoskeleton 18,23 rinneamar hipitéisiú go n-idirghníomhaíonn Specc1L le hacomhail ghreamaitheacha bunaithe ar actin (AJ).
.Taispeántar anseo trí cinn de na sé phointe ama (T1, T3, T6) a roghnaigh muid le haghaidh dlúis chille éagsúla..Taispeánann blot an Iarthair de Specc1L an banna 120 kDa ionchais agus banda meáchain mhóilíneach níos airde, a d'fhéadfadh a bheith modhnaithe go tar éis an aistrithe (*).Rinneadh anailís blot an Iarthair faoi na coinníollacha céanna le haghaidh cumar íseal agus ard.Tógadh íomhánna a thaispeánann specc1l ag cumar íseal agus ard ón mbloc céanna.Baineadh an blot céanna agus athscrúdaíodh antasubstaint β-actin.(H) Níor léirigh anailís chainníochtúil RT-PCR aon athruithe suntasacha ar leibhéil athscríbhinne spec1L.Is ionann barraí earráide agus SEManna ó cheithre thurgnamh neamhspleácha.
(AE) Roghnaigh muid sé phointe ama (T1-T6) a léiríonn raon dlúis cille chun anailís cruth cille a normalú agus athruithe AJ i gcealla U2OS le cnagadh spec1L (KD).I measc na gcéad chúig de na pointí ama seo bhí cealla aonair (T1), comhleá 50-70% de bhraislí cille beaga (T2), comhleá gan cealla KD a athmhúnlú (T3), athruithe KD (T4), agus athruithe 24 uair an chloig.i bhfoirm deiridh cealla KD (T5).Scaipeadh an próitéin Specc1L den chuid is mó sa chíteaplasma ag T1 (a), ach breathnaíodh a charnadh ag teorainneacha idircheallacha ag pointí ama ina dhiaidh sin (B -E, saigheada).(FJ) Taispeánann β-catenin carnadh comhchosúil ag teorainneacha idircheallacha a bhaineann le coimpléasc AJ.Taispeánann (A'-e ') specc1l agus β-catenin smálú forluí ag teorainneacha cille ag dlús ardchealla (saigheada).(F'-j ') I gcealla specc1l-kd, is cosúil go bhfuil staining β-catenin gnáth ag dlús íseal cille (F'-H'), ach leathnaíonn sé de réir mar a athraíonn cruth cille (i ', j'; saigheada), ag léiriú go bhfuil AJ tar éis athrú.Barraí = 10 µm.
Rinneamar iarracht ansin éifeacht easnaimh Specc1L ar AJ a chinneadh.D'úsáideamar roinnt marcóirí a bhaineann le AJ, lena n-áirítear na comhpháirteanna canónacha F-actin, myosin IIB, β-catenin, agus E-cadherin24,25,26,27.Mhéadaigh snáithíní struis actin i gcealla specc1l-kd mar a tuairiscíodh roimhe seo (Fíor 3A, B) 18.Léirigh Myosin IIB a bhaineann le filiméid actin méadú comhchosúil ar chealla specc1l-kd in vitro (Fíor 3C, D).Ceanglaíonn β-catenin a bhaineann le AJ le cadherin ag an gcill-scannán, ag taispeáint gnáthphátrún léirithe “cíor mheala” i rialaithe cubocytes (Fíor 3E, G).Is díol spéise é, in íomhánna cothroma ag baint úsáide as micreascópacht confocal, β-catenin (Fíor 3E, F) agus E-cadherin (Fíor 3G, H) a bhí ag smálú ar chill-chill na gceall comhréitigh-easnamhach-easnamhach patrúin shuntasacha staining leathnaithe.Rinneadh an leathnú seo ar dhathú β-catenin a bhaineann le AJ i gcealla KD a fhuaimniú ag cumar, ach bhí an chuma air go raibh sé roimh athruithe i gcruth na gceall (Fíor 2F-J, F'-J ').Chun nádúr fisiciúil an smálú AJ leathnaithe seo a chinneadh, scrúdaíomar teorainneacha cille ar dhromchla apical-basal na gceall U2OS Specc1L-KD trí mhicreascópacht leictreon tarchuir (TEM) (Figiúr 3i, J).I gcodarsnacht le cealla rialaithe (Fíor 3i), a raibh réigiúin dhlúth leictreon ar leithligh acu a léirigh AJ (saigheada), léirigh cealla KD (Fíor 3J) réigiúin mhóra, tadhlacha de dhlús ard -leictreon a léiríonn AJ feadh an phlána apicobasal..Ina theannta sin, ar rannóga trasnaí, bhreathnaíomar ar fhillteáin chill-chillín i gcealla KD (Fíor S1a, B), a mhíníonn an patrún sínte de bhanda daite β-catenin agus e-cadherin (Fíor 3F, H).Mar thaca le ról Specc1L in AJS, rinneadh β-catenin a chomh-imdhíonacht le specc1L i lysates de chealla U2OS (Fíor 3K).Chomh maith le himdhíonadh sínte le haghaidh marcóirí AJ, bhí anailís TEM ag teacht lenár hipitéis go méadaíonn easnamh specc1L dlús agus athraitheas AJ apical-basal.
(AH) Méadaigh smálú F-actin i gcealla KD ag 48 uair an chloig tar éis an chomhleá (T6; A, B).Smálú athraithe myosin IIB a bhaineann le F-actin (C, D).Feabhsaíodh patrún réidh β-catenin agus membrane e-cadherin i gcealla rialaithe (E, G) i gcealla specc1l-kd (F, H).Barraí = 10 µm.(I-J) Micreasceagraim leictreon ag breathnú ar an acomhal idircheallach apical-basal.Taispeánann cealla rialaithe réigiúin ar leith leictreon-dlúth a léiríonn acomhail ghreamaitheacha (I, saigheada).I gcodarsnacht leis sin, bhí an t-acomhal iomlán apical-basal i gcealla spec1L-KD le feiceáil go leictreon (j, saigheada), rud a léiríonn dlús méadaithe agus scaipeadh acomhail ghreamaitheacha..Íomhá a tógadh ó láthair amháin a sheasann do cheann de cheithre thurgnamh neamhspleácha.
Chun ról Specc1L a thuiscint i morphogenesis craniofacial, chruthaíomar samhail luiche easnamhach spec1L ag baint úsáide as dhá líne chealla gaiste neamhspleácha ES, DTM096 agus RRH048 (Baygenomics, CA), a léiríonn intron 1 agus gabhadh aistrithe spec1L ag 15 (Fíor 1) .4a, Fíor S2).Socraíodh suíomh géanómach an chur isteach veicteoir decoy trí sheicheamhú géanóm iomlán agus deimhníodh é ag PCR (Fíor S2).Cheadaigh an dá dhearadh gaiste géine comhleá in-fráma de na tuairisceoirí Spec111-LacZ nuair a gabhadh iad.Dá bhrí sin, baineadh úsáid as slonn LACZ arna chinneadh ag smálú X-gal mar tháscaire ar léiriú Specc11.Léirigh an dá ailléil patrúin léirithe LACZ den chineál céanna, leis an ngaiste géine DTM096 in Intron 1 a thaispeánann slonn níos láidre ná RRH048 in intron 15 (nár taispeánadh).Mar sin féin, cuirtear Specc1l in iúl go forleathan, le léiriú an -láidir sna folds néarach ag E8.5 (Figiúr 4B), sna próisis feadáin agus aghaidhe ag E9.5 agus E10.5 (Figiúr 4C, D), agus i bhforbairt géaga a fhorbairt ag E10.5 agus súile (Figiúr 4D).Thuairiscigh muid roimhe seo go raibh an abairt specc1l sa chéad áirse pharyngeal ag E10.5 i láthair sa epithelium agus i mesenchyme18 bunúsach, ag teacht le lineage CNCC.Chun léiriú specc1l a thástáil i CNCC, rinneamar rannóga cloigeann E8.5 (Figiúr 4E-J) agus E9.5 (Figiúr 4K-).Ag E8.5, tá folds néarach daite ag specc1l go dian (Fíor 4E, H), lena n -áirítear cealla atá daite le marcóirí NCC (Fíor 4G, J).Ag E9.5, specc1l (Fíor 4K, n) a bhfuil daite go láidir air, tá CNCC comh-dhaite le AP2A (Fíor 4L, M) nó Sox10 (Fíor 4O, P).
..Ne = neuroectoderm, nf = neural huaire, PA1 = an chéad áirse pharyngeal..Breathnaíodh go forleathan ar dhathú Specc1L i bhfillteáin néarach E8.5 (E, H; saigheadáin), lena n -áirítear cealla a bhfuil lipéad orthu le Ap2a (F, G; Arrowheads) agus Sox10 (I, J; Arrowheads).Ag E9.5, rinne Specc1l CNCCanna imirce (k, n; saigheada) a dhathú go láidir lipéadaithe AP2A (L, M; saigheada) agus Sox10 (o, p; saigheada).
Taispeánann an trasnú idir lucha heitrisigeach specc1ldtm096/+ agus specc1lrh048/+ nach bhfuil an dá ailléilí gaiste géine comhlántach agus go bhfuil heitrisigí cumaisc agus homaighnéadaigh suthacha le haghaidh ailléil géine géine marfach suthach (Tábla S1).Léirigh cóimheasa Mendelian laghdú ar an ráta marthanais de heitrisicíní ag am breithe (ag súil le 1.34 vs 2.0).Thugamar faoi deara go raibh básmhaireacht imbhreithe íseal i measc heitrisigeanna, bhí aimhrialtachtaí craniofacial ag cuid acu (Fíor S3).Mar sin féin, tá sé deacair staidéar a dhéanamh ar a meicníochtaí paitifiseolaíocha bunúsacha mar gheall ar threá íseal na bhfeinitíopaí craniofacial imbhreithe seo.Dá bhrí sin, dhírigh muid ar an feinitíopa marfach suthach a bhaineann le mutants specc11 homaighnéasach.
An chuid is mó de na heitrisigeach cumaisc nó homaighnéasaigh Specc1LDTM096/RRH048 Níor fhorbair suthanna mutant tar éis E9.5–10.5 (Figs. 5A - D), agus níor dhún an feadán néarach go héadrom (Figs. 5b, D) agus uaireanta dúnta go posterior (nach dtaispeántar) ..Bhí an fabht dúnta feadán néarach cranial bainteach leis an gcuid is mó de CNCC marcáilte DLX2 sna folds néarach ag E10.5, rud a léiríonn aon dioscadh (Figiúr 5a'-d ').Chun a fháil amach an laghdaíodh méid foriomlán CNCC freisin, rinneamar clibeáil ar línte CNCC le GFP inár línte gaiste géine le Wnt1-Cre agus Rosamtmg.Sruthlaimid GFP+ NCC agus GFP- (RFP+) neamh-NCC ó suthanna iomlána.Ag E9.5, níor athraigh an céatadán de CNCCanna a bhfuil lipéad GFP-lipéadaithe orthu go suntasach idir suthanna WT agus suthanna mutant (nár taispeánadh), ag léiriú gnáth-shonraíocht CNCC.Dá bhrí sin, rinneamar hipitéisiú go raibh smálú iarmharach WNT1-CRE agus DLX2 i bhfillteáin néarach nochta (Figiúr 5b ') mar gheall ar shraith lochtach CNCC, b'fhéidir mar gheall ar dhlús méadaithe nó scaipeadh cealla AJ, mar atá le feiceáil i gcealla spec1L-KD.D'úsáideamar na marcóirí NCC SOX10, AP2A, agus DLX2 chun láithreacht CNCC a dheimhniú sa fhilleadh néarógach (Figiúr 5E-R).Ag E8.5, breathnaíodh staining neural do na trí mharcóir NCC i gcodanna de WT (Fíor 5e, G, I) agus Mutant Specc1L (Fíor 5F, H, J).Ag E9.5, cé go ndearna marcóirí NCC daite ar NCC a imirce i rannóga WT (Fíor 5m, O, Q), breathnaíodh smálú iarmharach NCC i bhfillteáin néarach nochta suthanna mutant spec1L (Fíor 5N, P, R).Mar gheall ar SOX10 agus DLX2 Mark CNCCanna imirce, tugann an toradh seo le fios go mbaineann CNCCanna atá easnamhach le specc1L sonraíocht iar-imirceach amach ach go dteipeann orthu dul ar imirce ó fhillte néarach.
Mar thoradh ar easnamh Specc11, dúnadh feadán néarógach lochtach, dí -dhíláithriú na gceall suaitheantas néarach cranial agus AJanna.
.I gcodarsnacht leis sin, taispeánann suthanna Mutant Specc11 folds néarach oscailte (b), ceann saighead) agus CNCC nach bhfuil imirce orthu (B ', saigheadáin).(C, D ') Íomhánna allamuigh geala (C, D') agus imdhíonadh (C ', D') den Marker CNCC DLX2 de E10.5 WT suthanna (C, C ') agus Specc1l (D, D').I suthanna WT E10.5, DLX2-dearfach CNCC coilíniú na n-áirsí gill (C ', saigheada), agus i mutants, leanann smálú feiceálach sna folds néarach oscailte (D', saigheada) agus sa chéad áirsí cógaisíochta (D ', saigheada).) le roinnt smálú (saigheada) a léiríonn droch -dhí -dhílárú agus imirce CNCC.ER) Rinneadh codanna de suthanna mutant WT agus spec1L ag céimeanna E8.5 (E -L) agus E9.5 (M -R) a lipéadú le marcóirí NCC SOX10 (E, F, M, N), Ap2a (G, H, O, P) agus DLX2 (I, J, Q, R).Ag E8.5, breathnaíodh staining NCC i bhfilleadh néarach de chineál fiáin (NF) agus i gcodanna mutant.Léirigh comh-staining SOX10 agus β-catenin in E8.5 wt (k) agus mutant (L) go raibh méadú ar smálú β-catenin ag teorainneacha cille sna folds néarach.Ag E9.5, breathnaíodh staining de chineál fiáin ar CNCCanna imirce (m, o, q), agus i mutants, neamhthreoraithe CNCCanna daite nóral oscailte (n, p, r).(S - Z) Anailís lipéadaithe in vivo AJ i gcodanna corónacha de suthanna WT agus spec1dtm096/rrh048 leis an tsóchán E9.5.Taispeántar neas -eitleán rannóige sa chúinne uachtarach ar dheis.I gcodanna de fhíocháin shóiteáin, breathnaíodh smálú méadaithe F-actin (S, T) agus myosin IIB (U, V).Cosúil leis na torthaí in vitro i bhFíor 3, i suthanna mutant, breathnaíodh staining membrane feabhsaithe le haghaidh β-catenin (w, x) agus e-cadherin (y, z)..I gcodarsnacht leis sin, i gcodanna de suthanna mutant spec111 (BB, saigheada), tá an t -acomhal apicobasal iomlán dlúth, rud a léiríonn dlús méadaithe agus scaipeadh acomhail ghreamaitheacha.
Chun ár hipitéis a thástáil go bhfuil an tsraitheadh ​​laghdaithe mar gheall ar AJ athraithe, scrúdaíomar lipéadú AJ i bhfillteáin néarach nochta suthanna mutant spec1L (Fíor 5S-Z).Chonaiceamar méadú ar shnáithíní struis actin (Fíor 5S, T) agus logánú méadaithe comhchéimneach de dhathú myosin IIB ar shnáithíní actin (Fíor 5U, V).Rud atá tábhachtach, bhreathnaíomar ar dhathú méadaithe β-catenin (Fíor 5W, x) agus E-cadherin (Fíor 5y, z) ag teorainneacha idircheallacha.Scrúdaíomar freisin staining β-catenin de NCC i bhfillteáin néarach E8.5 suthanna (Fíor 5K, L).Bhí an chuma ar an scéal go raibh an staining β-catenin níos láidre i bhfillteáin neodracha spéisiúla (Fíor 5L agus K), ag tabhairt le tuiscint go raibh tús curtha le hathruithe AJ.I micrographs leictreon de chodanna cloigeann de suthanna E9.5, bhreathnaíomar arís ar smálú leictreon-dlúth idirleata i suthanna mutant spec1L i gcomparáid le WT (Fíor 5AA, BB agus S1E-H).Le chéile, tacaíonn na torthaí seo lenár dtorthaí in vitro i gcealla Specc1L-KD U2OS agus tugann siad le fios go dtagann staining Aberrant AJ roimh srathú CNCC inár suthanna mutant.
Mar gheall ar an ngaol freasaitheach aitheanta idir gníomhaíocht AKT agus cobhsaíocht E-cadherin, rinne 17,28 hipitéisiú ar rannpháirtíocht chomharthaíochta PI3K-AKT.Ina theannta sin, bhreathnaíomar ar bhláth subepidermal i gcuid dár suthanna mutant a d'éalaigh marfach (<5%) ag E9.5-10.5 agus ina ionad sin shocraigh siad thart ar E13.5 (Fíor S3).Is sainchomhartha de chomharthaíocht laghdaithe PI3K-AKT iad na veicíní subepidermal bunaithe ar PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) a thuairiscigh go mbíonn veicéidí subepidermal, lochtanna feadán néarach, agus feinitíopaí carball scoilte, mar thoradh ar chur isteach ar ghníomhachtú PI3K PDGFRα-bhunaithe i suthanna pdgfrapi3k/pi3k mutant.Go deimhin, laghdaíodh leibhéil PAN-AKT agus Ser473-AKT gníomhach in vivo i bhfíocháin shóiteáin Specc1L go dtí gabháil E9.5 (Fíor 6A-D).D'fhéadfadh an laghdú ar leibhéil phosphorylated Ser473-AKT a bheith go hiomlán mar gheall ar an laghdú ar leibhéil Pan-AKT in vivo (Fíor 6E) agus in vitro (Fíor 6F).Níor breathnaíodh laghdú in vitro ach amháin nuair a bhí cealla U2OS ag teacht go láidir le hathruithe i gcruth cille agus dlús AJ (Figiúr 6D).Dá bhrí sin, tugann ár gcuid sonraí le fios gur rialtóir dearfach núíosach é Specc1L ar chomharthaíocht PI3K-AKT i morphogenesis craniofacial.
(A-E) E8.5 (A, B) agus E9.5 (C, D) Rannáin cloigeann nó E9.5 Lysates ó suthanna mutant spec1L (E) a thaispeánann laghdú próitéine gníomhach fosfaictrithe S473-AKT agus PAN-AKT , i gcomparáid le rialú WT.Rinneadh blotáil an Iarthair ar lysates de chineál fiáin agus ar lysates mutant faoi na coinníollacha céanna.Tógadh na híomhánna a thaispeántar le haghaidh specc1l ó bhloc amháin.Baineadh an blot céanna agus athscrúdaíodh é le hantasubstaintí frith-pan-ACT agus β-actin.Laghdaíodh go mór leibhéil PAN-AKT i bhfillteáin néarach E8.5 (A, B) agus leibhéil S473-AKT i rannóga cloigeann E9.5.(F) Ar an gcaoi chéanna, laghdaíodh leibhéil PAN-AKT i lysates de chealla U2OS Specc1L-KD a lománaíodh ag cumar ard.Is ionann barraí earráide agus SEMS ó thrí chainníocht neamhspleách an Iarthair..Taispeánann suthanna Mutant Specc11 iomadú cille inchomparáide (I), ach tá méadú suntasach tagtha ar líon na gceall atá ag dul faoi apoptosis (J).
Scrúdaíomar ansin marcóirí iomadú agus apoptosis.Níor bhreathnaíomar ar aon difríocht i iomadú suthanna E9.5 (Fíor 6E, G i gcomparáid le I) le hinnéacs iomadú de 82.5% le haghaidh mutants WT agus 86.5% le haghaidh mutants specc1l arna thomhas ag staining Ki67 (p <0.56, Fisher's's's's Tástáil bheacht).Ar an gcaoi chéanna, níor bhreathnaíomar ar aon difríocht in apoptosis arna thomhas trí dhathú a dhéanamh ar chaspase 3 i bhfillteáin néarach ag E8.5 go dtí go ngabhfaidh suth (nár taispeánadh) (nár taispeánadh).I gcodarsnacht leis sin, tháinig méadú suntasach ar apoptosis i ngach suthanna mutant E9.5 (Fíor 6F, H agus J).Tá an méadú foriomlán seo ar apoptosis ag teacht le comharthaíocht laghdaithe PI3K-AKT agus marfach luath-suthach29,30,31.
Ansin, chun ról cúisíoch a dhearbhú do chomharthaíocht PI3K-AKT in athruithe AJ inár gcealla KD, d'athraigh muid go ceimiceach an cosán faoi rialú agus cealla KD (Figiúr 7A-F).D'úsáid muid mar chomhartha an feinitíopa cruth cille a breathnaíodh i gcealla comhréireacha specc1l-kd, a rinneamar cainníochtú ag baint úsáide as cóimheas na toise is faide (fad) leis an ngné ingearach chomhfhreagrach (leithead).Táthar ag súil le cóimheas de 1 do chealla réasúnta cruinn nó ciúbóideach (Fíor 7G).Chomh maith le cruth na gceall, dheimhníomar freisin an éifeacht ar AJ le staining β-catenin (Fíor 7a'-f ').Bhí toirmeasc ar an gcosán PI3K-AKT ag baint úsáide as wortmannin leordhóthanach chun cruth na gceall a athrú i gcealla rialaithe (Figiúr 7a, C) agus AJ (Figiúr 7A ').Ní raibh tionchar ag PI3K-AKT Activator SC-79 ar chruth na gceall (Fíor 7A, E) nó leathnú AJ (Fíor 7a ') i gcealla rialaithe.I gcealla Specc1L-KD, mar thoradh ar chosc breise an chonair PI3K-AKT, tháinig méadú ar apoptosis (Fíor 7B, D) agus méadú suntasach ar staining β-catenin (Fíor 7b '), ag teacht lenár mutants troma in vivo.Rud atá tábhachtach, chuir gníomhachtú an chonair PI3K-AKT feabhas suntasach ar chruth cille (Figiúr 7B, F) agus AJ feinitíopaí (Figiúr 7B ”).Rinneadh athruithe i gcruth na gceall a chainníochtú mar chóimheas cruinnithe cille (CCR) agus comparáid idir iad agus tábhacht mar a thuairiscítear thuas (Fíor 7G).Go deimhin, i gcealla rialaithe (Fíor 7G, CCR = 1.56), bhí cóireáil wortmannin leordhóthanach chun cruth na cille a athrú go suntasach (Fíor 7G, CCR = 3.61, P <2.4 × 10-9) a mhéid atá cosúil leis an méid a breathnaíodh i Specc1l.-KD cealla (Fíor 7G, CCR = 3.46).Ní raibh cóireáil wortmannin ar chealla specc1l-kd (Fíor 7G, CCR = 3.60, neamhbhríoch) níos suntasaí ná cealla KD neamhchóireáilte (Fíor 7G, CCR = 3.46, diomaibhseach) nó cealla rialaithe faoi chóireáil wortmannin (Fíor 7G)..Níos tábhachtaí fós, rinne SC-79 AKT AKT an feinitíopa fadaithe de chealla specc1L-KD a athchóiriú (Fíor 7G, CCR = 1.74, P <6.2 × 10-12).Deimhníonn na torthaí seo go rialaíonn Specc1L comharthaíocht PI3K-AKT agus tugann sé le fios go dtéann laghdú measartha ar Specc1L i bhfeidhm ar ghreamú cille, agus go dtiocfaidh laghdú láidir ar apoptosis (Fíor 8).
Rialú (A-F ') Rialú (A, C, E) agus Specc1l-KD (B, D, F) Cóireáil a ndéileáiltear leo le Pi3K-AKT Coscaire Coscaire Wortmannin (C, D) nó SC-79 Gníomhaire (E, F) Cóireáil Is iad na cealla rialaithe cóireáilte ciúbóideach (A) le gnáth-smálú ceallacha β-cat (A '), agus tá cealla KD fadaithe (b) le smálú β-cat méadaithe (B').Tar éis an cosán PI3K-AKT a chosc, cealla rialaithe atá fada (C) le leathnú β-cat (C '), agus thosaigh cealla KD ag dul faoi apoptosis (D), cosúil lenár suthanna ard-mhurtaithe agus ag taispeáint β-cat an-fheabhsaithe.staining (D ').Tar éis an chonair PI3K-AKT a ghníomhachtú, d'fhan cealla rialaithe ciúbóideach (E) agus bhí gnáth-smálú β-cat (E) acu, agus léirigh cealla KD cruth cille (F) agus β-cat (F) a bhí feabhsaithe go suntasach, ag léiriú smálú, ag léiriú smálú, .Bhí cealla neamhchóireáilte (NT) specc1l-kd (CCR = 3.46) i bhfad níos faide ná cealla rialaithe (CCR = 1.56, P <6.1 × 10–13).Bhí toirmeasc Wort ar chonair PI3K-AKT i gcealla rialaithe leordhóthanach chun fadú comhchosúil a chur i gcruth cille (CCR = 3.61, P <2.4 × 10-9).Ar an gcaoi chéanna, rinne gníomhachtú AKT ag SC-79 i gcealla spec1L-KD fadú cille a athchóiriú go leibhéil rialaithe (CCR = 1.74, P <6.2 × 10–12).Mar thoradh ar chóireáil wortmannin ar chealla Specc1L-KD, tháinig méadú ar apoptosis ach ní raibh aon mhéadú breise ar athrú cruth na gceall (CCR = 3.60) i gcomparáid le cealla rialaithe neamhchóireáilte (CCR = 3.46, NS) nó cealla rialaithe cóireáilte wortmannin (3.61) a breathnaíodh.Is cuma le NS =.Taispeántar tomhais +/- SEM do 50 ceall.Ríomhadh difríochtaí staitistiúla ag baint úsáide as t-thástáil na Mac Léinn.
.(B) Samhail bheartaithe do chobhsú próitéine Akt ag specc1l.
Éilíonn CNCCanna réamh -imirceacha go ndéanfaidh AJ lysis a dheighilt ó chealla neuroepithelial neuroepithelial neural neural1,15,32.Tugann smálú méadaithe na gcomhpháirteanna AJ agus an dáileadh neamhshiméadrach AJ apical-basal i gcealla spéisiúla-easnamhacha in vitro agus in vivo, in éineacht le gaireacht fhisiciúil spec1L go β-catenin, le fios go bhfuil feidhmeanna specc1L chun cobhsaíocht áitiúil AJ a chothabháil i gceart le haghaidh le haghaidh cobhsaí áitiúil le haghaidh cobhsaí áitiúil le haghaidh cobhsaí áitiúil le haghaidh cobhsaí AJ le haghaidh i gceart le haghaidh cobhsaí i gceart le haghaidh cobhsaí AJ le haghaidh i gceart le haghaidh cobhsaí go cuí le haghaidh cobhsaíocht cheart matáin eagraíochta.Actin Cytoskeleton.Tá comhcheangal specc1L leis an actin cytoskeleton agus β-catenin agus an méadú ar líon na bhfiliméid actin comhdhlúite in éagmais specc1L ag teacht leis an méadú breathnaithe ar dhlús AJ.Féidearthacht eile is ea go n-eascraíonn athrú ar theannas idircheallach as líon méadaithe snáithíní actin i gcealla easnamhacha spec1L.Toisc go dtéann strus ceallach i bhfeidhm ar dhinimic AJ 33, is féidir le hathruithe voltais níos mó idirleata AJ 34 a bheith mar thoradh air.Mar sin beidh tionchar ag aon athruithe ar shraitheanna CNCC.
Cuirtear WNT1 in iúl sna luathfhilltí néarach a chruthaíonn cealla suaitheantas néarógach.Dá bhrí sin, marcanna rianaithe lineage WNT1-CRE roimh an NCC35 roimh ré agus imirce.Mar sin féin, marcálann Wnt1 clóin fíochán inchinne droma freisin a dhíorthaítear ó fhillteáin luatha néarach 35,36, rud a fhágann gur dócha nach é an smálú ar E9.5 mutants do marcóirí Wnt1 i bhfillteán néarach oscailte CNCC.Dheimhnigh ár smálú dearfach do na marcóirí NCC AP2A agus SOX10 go raibh CNCC i bhfillteáin nochta néarach na suthanna Mutant Spec111.Ina theannta sin, ós rud é go bhfuil AP2A agus SOX10 ina marcóirí ar NCC luath-imirce, thug staining dhearfach le fios gur CNCC iar-imirceach iad na cealla seo nach féidir a srathú faoi E9.5.
Tugann ár gcuid sonraí le fios go ndéantar rialáil mhóilíneach AJ ag specc1l a idirghabháil le comharthaíocht PI3K-AKT.Laghdaítear comharthaíocht AKT i gcealla agus i bhfíocháin easnamhacha spec1L.Torthaí ag Fantauzzo et al.Tacú le ról díreach do chomharthaíocht PI3K-AKT i morphogenesis craniofacial.(2014) a léirigh go mbíonn feinitíopa carball scoilte scoilte mar thoradh ar easpa gníomhachtaithe PDGFRα-bhunaithe.Léiríonn muid freisin go bhfuil toirmeasc ar chonair PI3K-AKT leordhóthanach chun cruth AJ agus cille a athrú i gcealla U2OS.Ag teacht lenár dtorthaí, tá Cain et al.Léirigh 37 go bhfuil méadú comhchosúil ar dhathú pericellular β-catenin mar thoradh ar dhírialú an fho-aonad PI3K α110 i gcealla endothelial, dá ngairtear méadú ar an “innéacs nascachta”.Mar sin féin, i gcealla endothelial a bhfuil a gcuid filiméid actin eagraithe go mór cheana féin, bíonn cruth cille scaoilte mar thoradh ar chosc an chonair PI3K-AKT.I gcodarsnacht leis sin, léirigh cealla Specc1L-KD U2OS cruth cille fadaithe.D'fhéadfadh an difríocht seo a bheith sonrach don chineál cille.Cé go dtéann cosc ​​ar chomharthaíocht PI3K-AKT go buan ar an actin cytoskeleton, déantar an tionchar ar chruth na gceall a chinneadh trí athruithe ar an teannas de bharr athruithe ar dhlús agus ar eagrú snáithíní lárnacha actin.I gcealla U2OS, níor úsáid muid ach athruithe cruth cille mar chomhartha ar athrú agus ar aisghabháil AJ-easnamhach Specc1L.Mar fhocal scoir, déanaimid hipitéisiú go méadaíonn toirmeasc ar an gcosán Akt in easnamh specc1L cobhsaíocht AJ agus go laghdaíonn sé díláithriú i CNCC.
Is díol spéise é gur laghdaíodh leibhéil PAN-AKT in vitro agus in vivo chomh maith le leibhéil phosphorylated 473-AKT in éagmais specc1L, rud a thugann le tuiscint rialáil ar chomharthaíocht PI3K-AKT ag leibhéal cobhsaíochta próitéine Akt nó láimhdeachas.Ionchorpraíonn na géinte Specc1L agus MID1, a bhaineann le siondróm Opitz/GBBB, próitéiní a chobhsaíonn microtubules 18,22.Ní thuigtear go hiomlán an mheicníocht trína ndéantar cobhsú microtubule specc1l agus mid1 a idirghabháil.I gcás Specc1L, áirítear leis an gcobhsú seo aicéitiliú feabhsaithe ar fhothacar de mhicrotubules 18.Is féidir go n -úsáideann Specc1L meicníocht chomhchosúil chun próitéiní eile ar nós Akt a chobhsú.Tá sé léirithe go n -eascraíonn laghdú ar logánú membrane agus phosphorylation38 mar thoradh ar aicéitiliú iarmhair lísín sa phróitéin Akt.Ina theannta sin, tá gá le hathláithreacht an tslabhra K63 ag an iarmhar lísín céanna ar Akt dá logánú membrane agus dá ghníomhachtú39,40.I measc roinnt fachtóirí atá ag idirghníomhú le próitéiní specc1L a aithníodh i scáileáin dhá-hibrideacha giosta ard-tréchuir éagsúla, tá ceithre-CCDC841, ECM2942, APC agus UBE2I43-gafa le láimhdeachas próitéine nó cobhsaíocht trí athláithreacht nó sumoylation.D'fhéadfadh Specc1L a bheith páirteach i modhnú iar-aistritheach iarmhair lísín Akt, a théann i bhfeidhm ar chobhsaíocht AKT.Mar sin féin, tá an ról criticiúil atá ag specc1L i logánú agus i gcobhsaíocht an phróitéin Akt fós le soiléiriú.
Mar thoradh ar lochtanna tromchúiseacha i slonn Specc1L in vivo, tháinig méadú ar dhathú marcóra AJ agus ar fhorleagan lochtach CNCC, chomh maith le apoptosis méadaithe agus marfach luath suthach.Léirigh tuarascálacha roimhe seo go bhfuil baint ag mutants luiche le leibhéil mhéadaithe apoptosis le lochtanna feadán néarach 44,45,46,47 agus lochtanna craniofacial48.Moladh go bhféadfadh líon neamhleor na gceall a theastaíonn le haghaidh gluaiseachta morphogenetic cuí 48,49,50 mar thoradh ar bhás iomarcach cille sna folds néarach nó sna háirsí pharyngeal.I gcodarsnacht leis sin, níor léirigh ár línte cealla easnamhacha specc1L le slonn measartha laghdaithe Specc1L ach athruithe AJ gan fianaise ar bhás méadaithe cille.Mar sin féin, bhí apoptosis méadaithe mar thoradh ar thoirmeasc ceimiceach ar chonair PI3K-AKT sna cealla KD seo.Dá bhrí sin, cinntíonn laghdú measartha ar léiriú nó ar fheidhm spec1L marthanacht na gceall.Tá sé seo ag teacht leis an mbreathnóireacht go bhfuil suthanna neamhchoitianta Specc11 mutant a éalaíonn gabhála ag ST.E9.5 - b'fhéidir mar gheall ar éifeachtúlacht ghabhála géine laghdaithe - in ann a gcuid feadáin néarach a dhúnadh agus stopadh níos déanaí i bhforbairt, go minic le lochtanna craniofacial (Fíor S3).Chomh maith leis sin tá sé seo ag tarlú go neamhchoitianta suthanna specc1l heitrisigeach le neamhghnácha craniofacial - is dócha mar gheall ar éifeachtúlacht ghabhála géine méadaithe - chomh maith leis an gcinneadh i zebrafish ina gcuireann ceann den dá orthologues spec1L (spec1lb) ina gcúis le penotypes embryonic déanacha, caillteanas de chaillteanas de chaillteanas de chaillteanas de chaillteanas embryypes embryyfypes déanach, i measc na n -orthypes de chaillteanais, ag caillteanas, ag cailleadh, i gcillín embyypes, phenotypes embry -plb), géaga íochtaracha agus scoilteanna déthaobhacha51.Dá bhrí sin, is féidir le sócháin heitrisigeach a chailliúint i bhfeidhm a aithnítear in othair dhaonna a bheith ina gcúis le laigí beaga i bhfeidhm specc1L le linn morphogenesis craniofacial, leordhóthanach chun a gcuid cleachtaí orofacial a mhíniú.D'fhéadfadh ról a bheith ag rialachán teagmhálacha idircheallacha bunaithe ar specc1l freisin i palatogenesis agus comhleá na áirsí cógaisíochta.Cuideoidh staidéir bhreise ar fheidhm Specc1L le ról na dteagmhálacha idircheallacha sealadacha i CNCC a shoiléiriú le linn dúnadh feadán néarach i ngluaiseacht cille neuroepithelial agus i morphogenesis craniofacial.
Rinneadh cur síos roimhe seo ar rialú osteosarcoma U2OS agus ar chealla specc1l-kD (Saadi et al., 2011).Tá tréithe antasubstaintí in aghaidh Specc1L tréithrithe roimhe seo (Saadi et al., 2011).Antasubstaintí frith-β-catenin (coinín; 1: 1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (luch; 1: 1000; Teicneolaíocht Comharthaíochta Cealla, Danvers, MA), Myosin IIB (1: 1000; Sigma-Aldrich, St Louis ), Mo)), E-cadherin (1: 1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1: 1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), Sox10 (1: 1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego . ), Ki67 (1: 1000; Teicneolaíocht Comharthaíochta Cealla, Danvers, MA), Caspase 3 (1: 1000; Teicneolaíocht Comharthaíochta Cell, Danvers, MA) agus β-Actin (1: 2500; Sigma-Aldrich, St Louis, Baineadh úsáid as mo) mar a thuairiscítear..Daingníodh filiméid Actin le rhodamine phalloidin Acti-stain (cytoskeleton, Denver, Colorado).
Saothraíodh cealla rialaithe U2OS agus cealla Specc1L-KD i DMEM ard-ghlúcóis caighdeánach le 10% serum bólachta féatais (Life Technologies, Carlsbad, CA).Maidir le hathruithe AJ, rinneadh 2 x 105 ceall a shíolú ar ghloine a caitheadh ​​le 0.1% geilitín muc (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) agus breathnaíodh ar athruithe i gcruth na gceall.Bailíodh cealla ag pointí ama difriúla léirithe: 4 uair an chloig tar éis síolú (t = 1), 24 uair an chloig tar éis síolú (t = 2), cumar gan athrú i gcruth cille (t = 3), athrú i gcruth na cille (t = 4) , 24 h tar éis athrú cruth cille (t = 5) agus 48 h tar éis athrú cruth na gceall (t = 6) (Fíor 1, 2, 3).Chun an cosán PI3K-AKT a mhodhnú, saothraíodh na cealla ag na tiúchain léirithe leis an wortmannin coscaire PI3K-AKT (Tocris Biosciences, Minneapolis, Minnesota) nó gníomhaire SC-79 (Tocris Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Athraíodh an meán ina raibh na ceimiceáin gach lá.
Rinneadh taifeadtaí fráma-le-fráma ar rialú beo agus ar chealla KD faoi ghnáthchoinníollacha cultúir, agus bailíodh íomhánna codarsnachta céime gach 10 nóiméad ar feadh 7 lá.Fuarthas íomhánna ag baint úsáide as micreascóp inbhéartaithe Leica DM IRB atá faoi rialú ríomhaire le céim mheicniúil agus cuspóir 10 × N-Plan ceangailte le ceamara Retiga-SRV Qimaging.Le linn íomháithe, coinníodh cultúir na gceall ag 37 ° C in atmaisféar tais le 5% CO2.
Baineadh úsáid as dhá línte cealla gaiste géine DTM096 agus RRH048 ón Ionad Acmhainne Luiche Réigiúnach (UC Davis, CA) chun línte luiche easnamhacha a ghiniúint, sainithe spec1lgtdtm096 agus specc1lgtrh046.Go hachomair, instealladh cealla 129/Rej ES i mblastocysts C57BL6.Rinneadh na lucha fireann chimeric a bhí mar thoradh air a phórú le lucha ban C57BL6 ban chun sliocht a aithint le coloration cóta agouti.Baineadh úsáid as láithreacht iatáin veicteoir gaiste géine chun heitrisigeanna a aithint.Coinníodh lucha ar chúlra measctha de 129/Rej; C57BL6.Deimhníodh suíomh an tsuímh isteach sa veicteoir gaiste géinití ag RT-PCR, seicheamhú géanóm, agus comhlánú géiniteach (Figiúr Forlíontach 1).Chun lineage CNCC de lucha dúbailte heitrisigeach spec1lgt a rianú, rinneadh lucha rosamtmg (#007576) agus Wnt1-Cre (#003829) (Saotharlann Jackson, Bar Harbor, ME) chun an rosamtmg agus WNT1-cre allele a tháirgeadh i suthanna sonracha.Rinneadh gach turgnamh i lucha de réir prótacal a cheadaigh Coiste Cúram agus Úsáid Ainmhithe Institiúideach Ionad Leighis Ollscoil Kansas.
Socraíodh suthanna i (1% formaildéad, 0.2% glutaraldehyde, 2 mm MGCl2, 0.02% NP-40, 5 mm EGTA) ar feadh 60 nóiméad ag teocht an tseomra.Tar éis é a shocrú i dtuaslagán staining x-gal (5 mM ferricyanide potaisiam, ferrocyanide potaisiam 5 mM, 2 mm mgcl2, 0.01% deoxycholate sóidiam, 0.02% NP-40, 1 mg/ml x-gal) rinneadh forbairt stain ag 37 ° C .° C laistigh de 1-6 uair an chloig.Rinneadh suthanna a shíniú i 4% PFA agus rinneadh iad a shamhlú.
Maidir le blotáil an Iarthair, rinneadh cealla a líonta i maolán lysis éighníomhach (Promega, Fitchburg, WI) le meascán de choscairí próitéiní stoptha (Sigma-Aldrich, St Louis, MO).Próiseáladh lysates ar ghlóthacha réamhdhéanta Polyacrylamide TGX (Bith-Rad, Earcail, CA) agus aistríodh iad go Immobilon PVDF Scannáin (EMD Millipore, Billerica, MA).Cuireadh bac ar na seicní i 5% bainne i PBS ina raibh 0.1% idir.Rinneadh antasubstaintí a ghoradh thar oíche ag 4 ° C nó ar feadh uair an chloig ag teocht an tseomra.Baineadh úsáid as imoibrí ECL West Femto (Thermo Scientific, Waltham, MA) le haghaidh giniúint comharthaí.I gcás imdhíonachta, socraíodh suthanna thar oíche i 4% PFA/PBS agus cryopreserved.Cuireadh bac ar chriosanna fíochán i PBS ina raibh 1% gnáth-serum gabhar (Thermo Scientific, Waltham, MA) agus 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) agus ansin a ghoradh ag 4 ° C i ngobharán le linn an Oíche.le frith-antasubstaint agus antasubstaint thánaisteach fhluaraiseach (1: 1000) ar feadh 1 uair an chloig ag 4 ° C.Cuireadh rannóga daite i meán -mheán óir (Thermo Scientific, Waltham MA) agus fuarthas íomhánna cothroma ag baint úsáide as micreascóp cómhalartach Leica TCS SPE.Rinneadh gach imdhíonadh mar thrí thurgnamh neamhspleácha ar chirosections dhá suthanna mutant ar a laghad.Taispeántar turgnamh ionadaíoch.
Rinneadh cealla a ghoradh i maolán RIPA modhnaithe (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% gliocról, 2 mM EDTA, agus coscaire protease stoptha (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Go hachomair, rinneadh lysates a réamhphórú le coirníní maighnéadacha próitéine G (Teicneolaíochtaí Saoil, Carlsbad, CA) agus ansin ghoradh iad thar oíche ag 4 ° C. le frith-Specc1L nó IgG próitéin G baineadh úsáid as coirníní próitéine chun an t-anti a bhaint amach ag baint úsáide as an Anti ag baint úsáide as an Anti ag baint úsáide as an Anti ag baint úsáide as blocáil anti agus blocáil an Iarthair ag baint úsáide as, -β-catenin antasubstainte a bhfuil cur síos orthu os cionn na dturgnaimh CO-IP a thaispeántar ionadaíocht ar cheithre thurgnamh neamhspleácha.
Cuireadh cealla saothraithe seasta nó fíocháin suthacha luiche ar fáil don ionad micreascópachta leictreon in Ollscoil Kansas Medical Centre.Go hachomair, rinneadh samplaí a neadú i roisín 812 a leabú (Eolaíochtaí Micreascópachta Leictreon, Fort Washington, PA), polymerized thar oíche ag 60 ° C, agus iad roinnte ag 80 nm ag baint úsáide as ultramicrotome Leica UC7 le lann diamant.Rinneadh na rannóga a shamhlú ag baint úsáide as micreascóp leictreon tarchuir JEOL JEM-1400 a bhfuil gunna lab6 100 kV aige.
Conas an t -alt seo a lua: Wilson, Nr et al.Mar thoradh ar easnamh Specc1L tá cobhsaíocht mhéadaithe na n -alt spliced ​​agus laghdaítear dí -dhílárú na gceall suaitheantas néarach cranial.an eolaíocht.6, 17735;doi: 10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Ionduchtú agus difreáil an suaitheantas néarógach.(Springer Science + Meáin Ghnó; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, an Dr et al.Cealla suaithinse néarach cranial ag gluaiseacht: a ról i bhforbairt chraicneach.American Journal of Medical Genetics.Cuid A 155A, 270–279, doi: 10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: A fás agus a fhorbairt thar 20 bliain.Péidiatraí.Paiteolaíocht.Saotharlann.cógas.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig Ku agus Noten MM Briseadh i ngéineolaíocht na gcleachtaí orofacial.Treochtaí i Leigheas Móilíneach 17, 725–733, doi: 10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. agus Riley, meicníochtaí móilíneacha FM de imirce agus patrún cille suaithinseach cranial le linn forbartha craniofacial.Forbairt 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH agus Murray, Lip agus carball scoilte JK: Tuiscint ar thionchair ghéiniteacha agus chomhshaoil.trácht nádúrtha.Géineolaíocht 12, 167–178, doi: 10.1038/NRG2933 (2011).
Ingram, Cr et al.Morphogenesis neamhghnácha an chraicinn, na ngéaga, agus réigiún craniofacial i lucha fachtóir-6 (IRF6) a rialaíonn interferon.Genette Náisiúnta.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrord-Janvid, M. et al.Is cúis le sócháin ceannasacha i GRHL3 siondróm van der Waord agus cuireann sé isteach ar fhorbairt an periderm ó bhéal.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Déanann Harris, MJ agus Juriloff, DM nuashonrú ar liosta na mutants luch le lochtanna i ndúnadh feadán néarach agus dul chun cinn i dtreo tuiscint ghéiniteach iomlán ar dhúnadh feadán néarach.Imscrúdú ar lochtanna breithe.Cuid A, teratology cliniciúil agus móilíneach 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Rialaíonn comharthaíocht Fantauzzo, Ka & Soriano, PDGFralpha Pi3K-idirghabhála marthanas agus iomadú i bhforbairt chnámharlaigh trí chonair intracellular atá ag brath ar P53.Forbairt Gene 28, 1005–1017, doi: 10.1101/GAD.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND agus Murdoch, Jn Disseveled: maidir le leathnú cóineasaithe le dúnadh feadán néarach.Treochtaí i Néareolaíocht.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236 (03) 00212-1 (2003).