347 cruach dhosmálta feadánra coiled comhpháirt cheimiceach, Aithint próitéiní chaperone leukocyte daonna nua-fhreagrach interferon antigen-A (HLA-A) ag baint úsáide as mais-speictriméadracht tras-nasctha (CLMS)

Go raibh maith agat as cuairt a thabhairt ar Nature.com.Tá tú ag baint úsáide as leagan brabhsálaí a bhfuil tacaíocht CSS teoranta aige.Chun an taithí is fearr a fháil, molaimid duit brabhsálaí nuashonraithe a úsáid (nó Mód Comhoiriúnachta a dhíchumasú in Internet Explorer).Ina theannta sin, chun tacaíocht leanúnach a chinntiú, taispeánann muid an suíomh gan stíleanna agus JavaScript.
Sleamhnáin a thaispeánann trí alt in aghaidh an tsleamhnáin.Bain úsáid as na cnaipí cúil agus seo chugainn chun bogadh tríd na sleamhnáin, nó na cnaipí rialtóra sleamhnáin ag an deireadh chun bogadh trí gach sleamhnán.

Cur síos ar an Táirge

Feadáin Coil Cruach Dhosmálta 347L, Grád Cruach: SS347L

Cothaíonn an córas comharthaíochta interferon freagairt láidir cítocine ar raon leathan comharthaí pataigineacha agus intreacha paiteolaíocha ón gcomhshaol, rud a fhágann go n-ionduchtar fo-thacair de phróitéiní inducite interferon.Chuireamar mais-speictriméadracht tras-nasctha DSS-idirghabhála (CLMS) i bhfeidhm chun idirghníomhaíochtaí nua próitéine-próitéine a bhrath i réimse na bpróitéiní a tharchuirtear le interferon.Chomh maith leis na próitéiní inducible interferon a rabhthas ag súil leo, d’aithníomar freisin adduct tras-nasctha idirmhóilíneacha agus ionmhóilíneacha nua de phróitéiní canónacha in-inducite idirfearóin mar MX1, USP18, OAS3, agus STAT1.Dhírigh muidne ar bhailíochtú orthogonal ar thacar nua de líonraí próitéin inducible interferon déanta ag próitéiní HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) ag baint úsáide as comh-imdhíon-fhuarascadh agus a staidéar breise ag baint úsáide as samhaltú dinimic mhóilíneach.Léirigh samhaltú ar dhinimic chomhfhoirmiúil an choimpléasc phróitéin go leor suíomhanna idirghníomhaíochta a léirigh na hidirghníomhaíochtaí a aithníodh i dtorthaí CLMS.Le chéile, cuirimid i láthair staidéar píolótach ar CLMS chun coimpléisc chomharthaíochta nua a tharlódh de bharr interferon a aithint, agus táimid ag tnúth le húsáid níos leithne a bhaint as CLMS chun dinimic nua idirghníomhaíochtaí próitéine a aithint i micri-thimpeallacht an siadaí.
Sula gcuirtear tús le freagairt imdhíonachta oiriúnaitheach, cuireann córas cosanta dúchasach an óstaigh isteach freagra frithmhiocróbach arna idirghabháil ag teaghlach de chitocíní alfa-héiliciúla rúnda ar a dtugtar interferons (IFNs).Gníomhaíonn na ranganna IFN cineál I IFNα agus IFNβ freagraí ceallacha, lena n-áirítear stáit antiviral, proapoptotic, proinflammatory, agus antiproliferative.I ndaoine, tá 13 subtypes de IFNα ar eolas, go léir cnuasaithe ar chrómasóim 91. Is ionadh é, ní dhearnadh staidéar ach ar IFNα2 le haghaidh úsáide cliniciúla.Le déanaí, tugadh aird ar leith ar thaighde ar fhochineálacha eile IFNα.Léirigh staidéar le déanaí go bhfuil IFNα14 ar cheann de na isoforms is éifeachtaí chun macasamhlú HBV2 agus VEID-13,4 a shrianadh i gcomparáid leis an bhfochineál canónach IFNα2.
Tá sé cruthaithe go spreagann coimpléisc receptor interferon gníomhachtaithe de chineál I (IFNAR1 agus IFNAR2) cascáid aistrithe comhartha arna idirghabháil ag Janus kinases TYK2 agus JAK15,6.Tá na trasduchtóirí comhartha fosphorylate Janus kinases seo agus gníomhaithe próitéin tras-aistrithe (STAT1 agus STAT2) ar iarmhair tyrosine chun heterodimerization fearann-idirghabhála SH2 a thionscnamh6.Ina dhiaidh sin, ceanglaíonn IRF9 heitreadiméirí STAT le coimpléasc trimeric den ghéin fachtóir 3 spreagtha ag IFN (ISGF3), a aistríonn go dtí an núicléas agus a spreagann tras-scríobh níos mó ná 2000 géinte spreagtha interferon (ISGanna)5,6,7,8.
Is iad ISGanna cnámh droma an chórais imdhíonachta dúchasach, go háirithe mar fhreagra ar ionsaí víreasach.Mar chéad líne cosanta i gcoinne ionfhabhtú víreasach, imscarann ​​cealla go tapa idirghníomhaíochtaí fairsinge de phróitéiní ceallacha le raon leathan gníomhaíochtaí bitheolaíocha.Áirítear leis na próitéiní seo gabhdóirí aitheanta patrún, móilíní comharthaíochta, fachtóirí trascríobh, agus próitéiní a bhfuil feidhmeanna díreacha frithvíreasacha acu, chomh maith le rialtóirí diúltacha ar fhreagraí imdhíonachta9.Tagann cuid mhór den fhaisnéis ar ghníomhaíocht ISG ó scáileáin fheidhmiúla a úsáideann scáileáin ró-eisbhrú10,11 nó teicnící tosta géine (siRNA, RNAi agus CRISPR)12,13 ina gcuirtear ISGanna aonair in iúl nó ina gcuirtear bac orthu agus ina ndéantar tástáil ar a ngníomhaíocht ar víris éagsúla.Cé gur shocraigh na staidéir seo na hairíonna frithvíreasacha atá ag ISGanna aonair, ní fios go fóill meicníochtaí móilíneacha bunúsacha gach ISG.Glactar leis go ginearálta go n-idirghníomhaíonn go leor próitéiní le cítocínín amháin nó níos mó chun gníomhaíocht iomlán a chinntiú, agus mar sin idirghníomhaíonn ISGanna go díreach nó déantar a n-idirghníomhaíochtaí a idirghabháil le próitéiní ceallacha.Mar shampla, d'aithin staidéar próitéamamach fótatrasnasctha le déanaí ATPase VCP/p97 mar phríomh-chomhpháirtí idirghníomhaíochta IFITM3, as a dtagann lochtanna i sórtáil líosómach, láimhdeachas agus comhiompar IFITM3 le cáithníní víreasacha 14 .Ag baint úsáide as imdhíon-réamhshamhlú, d’aithníomar VAPA, próitéin a bhaineann le feisicle, mar chomhpháirtí idirghníomhaíochta le IFITM1/2/3 a dhéanann idirghabháil ar aibiú víreasach trí mheán colaistéaról, agus deimhníodh é seo le staidéar eile a úsáideann córas giosta dhá-hibrideach.Tacaíocht Eolaíoch 15 , 16 .
Próiseas bunúsach bitheolaíoch a bhaineann le hionfhabhtú agus claochlú urchóideach a shochtadh is ea cur i láthair antaiginí, a ndéantar idirghabháil trí mhóilíní coimpléascacha histo-chomhoiriúnachta móra (MHC).Déantar peptides (8-12 aimínaigéid fada) ó phróitéiní scoilte, a fhoirceanntar roimh am nó mífhillte a luchtú isteach san heterodimer MHC-I (comhdhéanta de slabhraí trom agus éadroma MHC-I, ar a dtugtar β-2-micreaglobulin; β2M) 17,18 .Iompraítear na triúir MHC-I cobhsaí mar thoradh air go dtí an dromchla cille, áit a gcuireann siad peiptídí intracellular i láthair do chealla T CD8+ (cealla T cíteatocsaineacha)17.Aithníonn agus scriosann cealla T na pataiginí seo agus na cealla a iompraíonn antaigin meall-shonrach.Dá bhrí sin, is minic a shochtann pataiginí agus cealla meall an próiseas cur i láthair antaiginí chun faireachas imdhíonachta a sheachaint.Ina theannta sin, déantar íosrialú ar MHC-I i 40-90% de thumaí daonna agus is minic a bhaineann sé le prognóis níos boichte19.
Ní mór do ghéinte a bhfuil baint acu le freagairt do phataiginí aistriú go tapa idir staid scíthe agus staid trascríobh gníomhach.Dá bhrí sin, tá hipitéisiú ar roinnt próitéiní ceallacha a bheith páirteach sa fhreagra ar éileamh ard IFN thar thréimhsí gearra ama, lena n-áirítear athmhúnlú agus modhnú chromatin tionscnóra 20,21 .Dhírigh formhór na staidéar ar shainaithint comhpháirtithe próitéine ISG aonair i láthair IFN.Thug roinnt staidéar próitéamaíoch agus tras-traipeolaíoch i gcórais samhailchealla soiléiriú ar éifeacht IFN ar an tírdhreach ceallacha.Mar sin féin, in ainneoin tuiscint mhéadaithe ar an dinimic a tharlódh de bharr interferons, is beag atá ar eolas againn fós faoi rannpháirtíocht ISGanna.Agus castacht agus dinimic ama-spleách na comharthaíochta interferon á mbreithniú, tagann dhá cheist chun cinn: (i) an féidir na coimpléisc ilphróitéin a bhaineann le comharthaíocht thapa a chobhsú agus a ghafa, agus (ii) an féidir na hidirghníomhaíochtaí seo a mhapáil isteach sa spás 3T?
Chun aghaidh a thabhairt ar na saincheisteanna seo, chuireamar tras-nascadh ceimiceach fo-idirghabhála disuccinimide i bhfeidhm in éineacht le mais-speictriméadracht (CLMS) chun staidéar a dhéanamh ar líonra idirghníomhaíochta próitéine IFNα-spreagtha agus a dhinimic.Cuireann DSS naisc chomhfhiúsacha idir iarmhair chóngaracha próitéiní agus/nó coimpléisc próitéine in vivo.Nochtann anailís MS ina dhiaidh sin suíomhanna trasnasctha sonracha a léiríonn cóngaracht spásúil na réigiún laistigh de phróitéin ar leith, ar a dtugtar naisc inmheánacha, nó fo-aonaid i gcoimpléisc próitéine, ar a dtugtar idirghaolta.Ag baint úsáide as an gcur chuige seo, tá roinnt coimpléisc núíosacha próitéine-próitéine aitheanta againn chomh maith le líonraí idirghníomhaíochta ilphróitéine arna dtionscnamh ag interferon.Trí thástáil bhreise a dhéanamh ar fho-thacar de na hidirghníomhaíochtaí nua seo, léirímid go bhfeidhmíonn H2BFS (H2B histone-type FS; dá ngairtear H2B anseo feasta) agus MDN1 mar chomhpháirtithe ceangailteacha do HLA-A.
Tá cealla Flo-1 ar cheann de na samhlacha in vitro is fearr aithne d’adenocarcinoma esophageal mar go ndéanann siad aithris ar phríomhghnéithe siadaí esophageal22,23.Mar sin féin, níl gach siad imdhíon-ghineach, agus chun a chinneadh an bhfreagraíonn cealla Flo-1 do chóireáil interferon, chuireamar cóireáil ar chealla Flo-1 le 10 ng/ml IFNα ar feadh 72 uair an chloig.Léirigh cealla Flo-1 ionduchtú luath pSTAT1 agus IRF1, ag tosú 2 uair tar éis cóireála agus ag leanúint ar aghaidh ar feadh 72 uair an chloig, le laghdú ar leibhéil stadach IRF1 (Fíor 1A).Fuarthas amach go raibh ISGanna (MX1, IFITM1, OAS1/2, agus ISG15) ionduchtaithe go láidir tar éis 6 huaire an chloig, ag déanamh aithrise ar na freagraí céime lár agus déanach ar IFNα (Fíor 1A).Le chéile, tugann na sonraí seo le tuiscint gur féidir an tsamhail cheallacha seo a úsáid chun staidéar a dhéanamh ar fhreagraí interferon.
Freagraí difreálach léirithe próitéine i gcealla Flo-1 tar éis cóireála IFNα.(A) Rinneadh anailís ar abairt próitéine i gcealla Flo-1 a ndearnadh cóireáil orthu le 10 ng/ml IFNα ar feadh 2, 6, 24, 48 agus 72 uair ag immunoblot ag baint úsáide as an antasubstaintí ISG léirithe.(B) glóthacha SDS-PAGE dhaite gorm Coomassie d'sleachta iomlána cille tar éis tras-nascadh le DSS le haghaidh amanna agus comhchruinnithe sonraithe.(C) Scrúdaíodh imdhíonadh ionadaí le hantasubstaint p53(DO-1) ó na samplaí céanna chun measúnú a dhéanamh ar an méid tras-nasctha próitéine.
Chun an tírdhreach idirghníomhaíochta próitéine in situ a ghabháil, d'úsáideamar DSS, gníomhaire tras-nasctha a úsáidtear go forleathan mar gheall ar a thréscaoilteacht ard membrane agus a chuid ama imoibrithe sách gearr.Cuidíonn an t-am imoibrithe níos giorra chun comhiomláin mhóra de phróitéiní tras-nasctha a chosc, rud a chothaíonn cobhsaíocht an chroscheangail.Chun an tiúchan DSS is fearr a chinneadh agus ró-thrasnasc a sheachaint, rinneamar na cealla a nochtadh ar dtús chuig 5, 2.5, agus 1 mM DSS ar feadh 5, 10, 5, agus 30 nóiméad, faoi seach, agus rinneamar anailís ar na lysates ag SDS-PAGE dhaite le Coomassie. (sonraí gan taispeánta).Is cosúil go bhfuil lysates cille an-trasnasctha ag an tiúchan is ísle agus ag an bpointe ama is giorra.Mar sin, tugadh toirtmheascadh DSS go 1, 0.5, agus 0.1 mM thar 5 nóiméad (Fíor 1B).Breathnaíodh an tras-nascadh is fearr le 0.5 mM DSS ar feadh 5 nóiméad, agus roghnaíodh na coinníollacha seo do chealla a ndearnadh cóireáil orthu le IFNα.Ina theannta sin, léiríonn Fíor 1C blot an Iarthair a rinneadh ag baint úsáide as an antasubstaint p53 (DO-1) chun an méid tras-nasctha próitéine a mheas.
Cóireáladh cealla Flo-1 le 10 ng/ml IFNα ar feadh 24 uair an chloig roimh an traslinker a chur leis.Rinneadh cealla tras-nasctha a líseáil ina dhiaidh sin le próitéalú dhá chéim agus próiseáladh próitéiní ag FASP (Fíor 2)24,25.Rinneadh anailís ar peptides tryptic tras-nasctha de réir mais-speictriméadrachta (Fíor 2).Déantar na speictrim MS/MS a mheaitseáil ansin leis an seicheamh próitéine agus a chainníochtú le MaxQuant26,27.Aithníodh peiptídí tras-nasctha ón speictrim a fuarthas ag baint úsáide as an gclár SIM-XL, agus cuireadh comhdhúile aonair le chéile i líonra casta ag baint úsáide as píblínte bogearraí ríomhaireachta foinse oscailte xQuest28 agus SIM-XL29 (Fíor 2).Aithníonn SIM-XL idirghníomhaíochtaí próitéine-próitéine, slabhraí inmheánacha agus slabhraí aonair i meascáin próitéine simplí nó casta agus cuireann sé scripteanna ar fáil chun idirghníomhaíochtaí i struchtúir próitéine a léirshamhlú.Ina theannta sin, rangaíonn sé gach crostagairt mar scór aitheantais de réir cháilíocht speictrim MS/MS29.Sainaithníodh roinnt idirghníomhaíochtaí agus coimpléisc próitéine-iontaofa, agus tá tuilleadh imscrúdaithe déanta ar shraith nua idirghníomhaíochtaí ag baint úsáide as comh-imdhíon-fhuascailt agus athruithe comhfhoirmithe ar choimpléisc ag baint úsáide as samhaltú dinimic mhóilíneach (MD) (Fíor 2) 30, 31.
Forbhreathnú scéimreach ar an modh CLMS.Cóireáladh cealla Flo-1 le 10 ng/ml IFNα ar feadh 24 uair agus ina dhiaidh sin tras-nascadh próitéine in situ ag baint úsáide as DSS agus lysis cille agus trypsinúchán ina dhiaidh sin.Rinneadh anailís ar shamplaí tras-nasctha ag baint úsáide as mais-speictriméadar Orbitrap agus sampláladh tuilleadh le haghaidh ilroinnt réamhtheachtaithe peiptíde le linn LC-MS/MS.Aithníodh dhá pheptídí nasctha ón speictrim a fuarthas ag baint úsáide as an gclár Meaisín Aitheantais Speictrim na Peptides Trasnasctha (SIM-XL), agus cuireadh na comhdhúile go léir le chéile i líonra casta ag baint úsáide as píblínte ríomhaireachtúla.Scag amach idirghníomhaíochtaí ísealmhuiníne bunaithe ar scóir ráta dearfach bréagach (FDR).Deimhníodh tuilleadh idirghníomhaíochtaí próitéine-dílis ard-dhílseachta ag baint úsáide as comh-imdhíon-fhuascailt, agus scrúdaíodh athruithe comhfhoirmithe sna coimpléisc ag baint úsáide as samhaltú dinimic mhóilíneach (MD).
Braitheadh ​​~30,500 agus ~28,500 peptides san iomlán ag baint úsáide as MaxQuant i samplaí IFNα neamhspreagtha agus spreagtha, faoi seach (Tábla Forlíontach S1, Fíor 3A).Léirigh an dáileadh fad peptide sa dá chás cion níos airde de peptides níos mó, rud a léiríonn láithreacht peptides tras-nasctha (Fíor 3 B, C).Ina theannta sin, bhí céatadán níos mó de peptides níos mó i láthair sa raon 40-55 i samplaí cóireáilte IFNα ( Fíor. 3 C ).Léirigh mapáil próitéine i gcoinne déine log2 go raibh próitéiní spreagtha interferon clasaiceach na cinn is flúirseach i gcomparáid le samplaí neamhchóireáilte, lena n-áirítear MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58, agus HLA-F (Fíor 3D).Léirigh anailís ar bhealaí le haghaidh próitéiní níos mó ná trí huaire saibhrithe mar fhreagra ar chóireáil IFNα ag baint úsáide as an mbunachar sonraí cosán Reactome gurb é cur i láthair agus próiseáil antaiginí MHC-I-idirghabhála an cosán ba mhó (Fíor 3E).Ag teacht le tuairiscí níos luaithe, bhí freagraí frithvíreasacha a rinne OAS agus ISG15 mar aon le comharthaíocht IFNα/β agus cítocín i measc na mbealaí a cuireadh i ngníomh.Ina theannta sin, sainaithníodh tras-naisc phróitéin a bhain go sonrach le lísín agus sáirnín ón speictrim MS/MS a fuarthas ar dtús ag baint úsáide as SIM-XL.Thuairiscigh staidéar a rinneadh le déanaí 104 ISG a chuimsigh 20 víreas ó 9 rang víreas trí mheit-anailís ar staidéir aonair ró-léirithe ISG i 5 chineál cille9.Mar sin féin, chun na teorainneacha ríomhaireachtúla a bhaineann le scagadh tacair shonraí móra a shárú, chuireamar tús le tacar sonraí níos lú chun idirghníomhaíochtaí féideartha idir liosta na ngéinte IRDS a thuairiscigh Padaria et al., ar ISGanna a bhformhór a fhiosrú.
Aithint próitéiní tras-nasctha arna gcur in iúl go difreálach mar fhreagra ar IFNα (sonraí faighte ó MaxQuant).(A) Léaráid Venn a léiríonn líon na n-peiptídí coitianta agus eisiacha a aithníodh i samplaí Flo-1 cóireáilte agus neamhchóireáilte IFNα14.Dáileadh fad peptide ar shamplaí trasnasctha neamhchóireáilte (B) agus cóireáilte le IFNα (C).(D) Léarscáil teasa a léiríonn log2 (déine LFQ) idir cealla Flo-1 cóireáilte gan chóireáil agus IFNα14.Taispeánann an painéal ar chlé na próitéiní is gníomhaí i láthair IFNα.(E) Histeagram a ionadaíonn do na 20 mórbhealach saibhrithe tar éis cóireála IFNα.Rinne bunachar sonraí conairí Reactome anailís ar níos mó ná athruithe faoi cheathair ar phróitéiní a fhreagraíonn do IFNα atá faoi rialáil.
Tá dea-dhoiciméadú ar spreagadh ISG interferon-mediated, ach ag an leibhéal móilíneach ní thuigtear go dona conas a chríochnaíonn na próitéiní seo le raon leathan feidhmeanna bitheolaíocha.Rinneamar imscrúdú ar idirghníomhaíochtaí próitéine le leibhéal ard muiníne idir ISGanna aitheanta.Suimiúil go leor, d’aithin muid líonra lena n-áirítear próitéiní MX1, USP18, ROBO1, OAS3, agus STAT1 atá mar choimpléasc mór mar fhreagra ar chóireáil IFNα (Fíor 4, Tábla S2) 32,33,34.Níos tábhachtaí fós, fuarthas na hidirghníomhaíochtaí seo i ngach triarach cóireáilte le IFNα agus níor aimsíodh iad i samplaí neamhchóireáilte, rud a thugann le tuiscint gur foirmíodh iad go sonrach mar fhreagra ar chóireáil IFNα.Tá sé ar eolas go rialaíonn STAT1 léiriú na ISGanna seo go trascríobh, ach níl staidéar déanta ar a idirghníomhaíocht le ISGanna ag an leibhéal próitéine.Léirigh struchtúr criostail STAT1 nach bhfuil baint ag a bhfearann ​​​​helical (CCD) leis an idirghníomhú le DNA nó prótóirí le linn foirmiú dimers35.Cruthaíonn na α-helices seo struchtúr héilics héilice a sholáthraíonn achar dromchla hidreafail den chuid is mó le go dtarlóidh idirghníomhaíochtaí 35 .Inár sonraí CLMS, thugamar faoi deara gur tharla an chuid is mó de na hidirghníomhaíochtaí le STAT1 san fhearann ​​SH2 roimh an CCD, an fearann ​​nascóra, nó an t-eireaball C-críochfort (iarmhair 700-708) (Fíor 4A).Thuairiscigh staidéar roimhe seo go gceanglaíonn USP18 leis an CCD agus fearann ​​ceangailteach DNA (DBD) de STAT2 agus earcaítear é chuig an bhfo-aonad den chineál I gabhdóir interferon IFNAR2 chun idirghabháil a dhéanamh ar chosc ar chomharthaíocht interferon de chineál I 24 .Léirigh ár sonraí freisin go n-idirghníomhaíonn fearann ​​catalaíoch USP18 le STAT1 DBD (Fíor 4A, D), rud a thugann le tuiscint go bhféadfadh ról a bheith ag STAT1 agus STAT2 araon maidir le USP18 a mhealladh chuig IFNAR2.
Líonra ISG próitéine-próitéin aitheanta i gcealla tras-nasctha atá cóireáilte le IFNα.(A) plota idirghníomhaíochta 2D a thaispeánann idirghníomhaíochtaí próitéine-próitéine (a ghintear sa chlár SIM-XL), le línte a ionadaíonn idirghníomhaíochtaí idirmhóilíneacha (scoith trasnasc socraithe go 3.5).Tá fearainn ina bhfuil féiniúlachtaí difriúla marcáilte ag a ndath32: fearann ​​MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547), agus GED (569–660).Fearainn OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), agus OAS1_C (903-108).Fearann ​​ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) agus fn3 (777–864).Réimsí STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), agus STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Breathnóir ciorclach ar phróitéiní tras-nasctha (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1, agus STAT1) le hidirghníomhaíochtaí agus idirghníomhaíochtaí lipéadaithe i gorm agus dearg, faoi seach.Socraíodh an tairseach tras-naisc ag 3.5.Léiríonn ceapacha ponc suímh idirghníomhaíochta STAT1 le MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), agus OAS3 (F), chomh maith le suíomhanna idirghníomhaíochta K nó S idir an dá pheptídí.San fhigiúr, socraítear an tairseach scór tras-naisc go 3.0.(G) Láithreáin idirghníomhaíochta éagsúla idir fearainn STAT1 agus OAS3 DI forshuite ar a struchtúir próitéine in PyMol (córas grafaic móilíneach PyMOL, leagan 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) agus OAS3 (pdb id: 4s3n34).) clár.
Tá cur síos déanta ar dhá isoform de USP18 i ndaoine, próitéin lán-fhad atá lonnaithe go príomha sa núicléas, agus isoform gan fearann ​​N-críochfort, USP18-sf, atá scaipthe go cothrom sa chíteaplasma agus sa núicléas 36 .Ina theannta sin, measadh go raibh an N-críochfort neamhstruchtúrtha agus ní gá gníomhaíocht isopeptidase nó ceangailteach ISG1537.Bhí an chuid is mó de na hidirghníomhaíochtaí a aithníodh inár staidéar lonnaithe ag críochfort N an phróitéin, rud a thugann le tuiscint go mbaineann USP18 lán-fhad (Fíor 4A, D) leis na hidirghníomhaíochtaí seo agus mar sin is dócha go dtarlóidh siad sa núicléas.Thairis sin, léiríonn ár gcuid sonraí freisin go bhfuil an N-críochfort speisialaithe le haghaidh idirghníomhaíochtaí próitéine-go-próitéin.Tá suíomh ceangailteach IFNAR2 suite idir iarmhair 312-368, agus go háirithe, níl aon cheann de na próitéiní sa choimpléasc ceangailte leis an réigiún seo (Fíor 4A) 37,38 .Tugann na sonraí seo le chéile le fios go n-úsáideann an próitéin gabhdóra go heisiach fearann ​​ceangailteach IFNAR2.Ina theannta sin, fuarthas nach raibh ach OAS3 agus ROBO1 bainteach le fearainn in aghaidh an tsrutha ó shuíomh ceangailteach N-terminus agus IFNAR2 (Fíor 4A).
Baineann ROBO1 leis an superteaghlach imdhíon-ghlóbailin (Ig) de mhóilíní comharthaíochta transmembrane agus tá sé comhdhéanta de chúig réimse Ig agus trí fhearann ​​​​fibronectin (Fn) sa réigiún eischeallach.Ina dhiaidh na fearainn eischeallacha seo tá réigiún membrane-proximal agus héilics trasmembrane singil 39. Tá réigiún neamhstruchtúrtha incheallach suite ag an gcríochfort C agus tá móitífeanna seichimh chaomhnaithe ann a dhéanann idirghabháil ar cheangal próitéin éifeachtora39.Tá an réigiún a théann ó aimínaigéid ~ 1100 go 1600 neamhord den chuid is mó.Fuaireamar amach go n-idirghníomhaíonn MX1 le ROBO1 trí fearainn Ig, Fn, agus intracellular, cé go dtarlaíonn formhór na n-idirghníomhaíochtaí le STAT1 idir a CCD, fearann ​​nascóirí, agus críochfort C ROBO1 (Fíor 4A,E).Ar an láimh eile, dáileadh idirghníomhaíochtaí le réigiúin nascóirí DI, DIII, agus OAS3 ar fud an phróitéin ROBO1 (Fíor 4A).
Glacann agus ceanglaíonn an teaghlach próitéin oligoadenylate synthase (OAS) RNA dúbailte-shnáithe intracellular (dsRNA), déantar athruithe comhfhoirmiúla, agus sintéisíonn sé oligoadenylates 2′,5′-nasctha (2-5 As) 40 .Fuarthas amach, i measc na dtrí OAS, go léiríonn OAS3 an cleamhnas is airde do dsRNA agus go ndéanann sé an méid is lú de 2-5 As a shintéisiú, ar féidir leis RNase L a ghníomhachtú agus ar an gcaoi sin teorainn a chur le macasamhlú víreasach 41 .Is éard atá sa teaghlach OAS fearainn nucleotide transferase béite (pol-β) cosúil le polaiméaráis.Tá sé léirithe ag taighde roimhe seo go bhfuil gníomhaíocht chatalaíoch an fhearainn C-críochfort (DIII) ag brath ar an bhfearann ​​ceangailteach dsRNA (DI), atá ag teastáil chun OAS342 a ghníomhachtú.Thugamar faoi deara go n-idirghníomhaíonn na fearainn DI agus DII de OAS3 le CCD agus le réigiún acomhal beag idir SH2 agus STAT1 TAD (Fíor 4A, F).Forleagan suímh crosslinking éagsúla ar an struchtúr próitéin le fios ar idirghníomhaíocht idir an β-bhileog agus DBD STAT1 lúb agus póca oscailte nó cuas déanta ag iarmhair 60-75 i bhfearann ​​DI de OAS3 ( Fíor. 4 G ).Léirigh treoshuíomh na bpróitéiní sa choimpléasc freisin nár chuir aon cheann de na hidirghníomhaíochtaí le OAS3 isteach ar chumas DNA-cheangailteach a bhfearann ​​DI ( Fíor. S1 A ).Ina theannta sin, idirghníomhaíonn fearann ​​N-críochfort GTPase MX1 go forleathan leis na fearainn DI agus DIII de OAS3 (Fíor 4A).Chomh maith leis sin, thugamar faoi deara idirghníomhú idir OAS1 agus MX1 i ngach ceann de na trí athchraoladh a ndearnadh cóireáil orthu le IFNα, áit a ndearna fearann ​​amháin OAS1 (gníomhach catalaíoch freisin) idirghníomhú leis na trí fhearann ​​MX1 (Fíor S2A,B).
Tá próitéiní MX mar chuid de theaghlach mór GTPas cosúil le dynein ina bhfuil fearann ​​​​GTPase N-críochfort a cheanglaíonn agus a hidrealaíonn GTP, fearann ​​​​idirmheánach a dhéanann idirghabháil féin-chóimeála, agus zipper leucine C-críochfort a fheidhmíonn mar GTPase (LZ ).éifeacht fearainn fearainn25,43.Ceanglaíonn MX1 le fo-aonaid de pholaiméiráis víreasacha le bac a chur ar thrascríobh na géine víreasach43.Léirigh scáileán dhá-hibrideach giosta a tuairiscíodh roimhe seo go gcuireann MX1 a bhaineann le PIAS1 bac ar ghníomhachtú géine STAT1-idirghabhála trí ghníomhaíocht nasctha DNA a bhlocáil agus go bhfuil gníomhaíocht ligáis SUMO E344,45 aige freisin.Anseo, léirímid go gceanglaíonn MX1 le STAT1 (Fíor 4C, D), áfach, tá gá le tuilleadh staidéir ar conas a théann an idirghníomhaíocht seo i bhfeidhm ar ghníomhachtú géine trí mheán STAT1 mar fhreagra ar IFNα.Ina theannta sin, fuaireamar amach freisin go ndearna MX1 idirghníomhú le IFIT3 agus DDX60 i ngach ceann de na trí athchraoladh cóireáilte le IFNα (Fíor S2C).
Is héileacás cíteaplasmach IFN-spreagtha é DDX60 a tuairiscíodh roimhe seo go bhfuil ról aige i ndíghrádú neamhspleách RIG-I ar RNA46 víreasach.Idirghníomhaíonn sé le RIG-I agus cuireann sé a chomharthaíocht i ngníomh ar bhealach a bhaineann go sonrach le ligand 46. Is éard atá i DDX60 ná fearann ​​héileacás DEXD/H-Bosca agus fearann ​​héileacaptair C-críochfort a cheanglaíonn RNA víreasach agus DNA47.Tarlaíonn an chuid is mó dá idirghníomhaíochtaí le MX1 agus IFIT3 laistigh de réigiúin chríochfoirt fhada N- agus C gan fearainn chanónacha ná móitífeanna (Fíor S2E,F).Mar sin féin, tá baint ag MX1 freisin leis an bhfearann ​​​​helicase DEXD/H-Bosca (Fíor S2E).Tá cóipeanna comhuaineacha ag próitéiní an teaghlaigh IFIT de mhóitíf sainiúil héilics-cas-helix ar a dtugtar an t-athrá tetrapeptide (TPR).Fuarthas amach go raibh IFIT3 ina mhodhnóir dearfach ar chomharthaíocht RIG-I agus mar sin ina chuid de choimpléasc MAVS.Le chéile, tugann ár sonraí le fios go n-idirghníomhaíonn IFIT3 agus DDX60 go príomha sa réigiún idir TPR 3-6 de IFIT3 agus go bhféadfadh ról a bheith acu i gcomharthaíocht RIG-I/MAVS (Fíor S2F).
Ós rud é go bhfuil an scagthástáil ar an bpróteome iomlán dian ó thaobh ríomhaireacht de, rinneamar scagadh ansin ar bhunachar sonraí iomlán UniProt daonna chun go mbeadh ceann de na hathchraoltaí a chóireáiltear le IFNα i láthair.Sa macasamhail seo, fuaireamar roinnt líonraí idirghníomhaíochta an-iontaofa do HLA-A.Léirigh anailís ar bhealaí próitéine a d'aithin speictream MS / MS go bhfuil próiseáil agus cur i láthair antaiginí MHC-I-bhunaithe ar an bpríomhbhealach a tharlódh interferon ( Fíor. 3 D ).Dá bhrí sin, dhírigh muid ar staidéar a dhéanamh ar idirghníomhaíochtaí próitéine móilíní MHC-I le leibhéal ard muiníne i ngach sampla tras-nasctha.Tá HLA comhdhéanta de fearainn α1, α2 agus α3 agus slabhraí solais, agus is próitéin chaperone leanúnach é microglobulin β2 (β2m)49.Nuair a chuirtear le chéile é sa reticulum endoplasmic, tá HLA éagobhsaí in éagmais ligands peptide50.Tá an groove peptide-ceangailteach déanta ag na fearainn α1 agus α2 an-il-il-ilchineálach agus neamhstruchtúrtha i bhfoirm neamh-peptide agus an fearann ​​α351 polymorphic réasúnta níos lú.I láthair IFNα, bhraitheamar dhá choimpléasc HLA-A: idirghníomhaíonn ceann amháin le HMGA1 agus H2B (Fíor 5, Tábla S3) agus idirghníomhaíonn an ceann eile le MDN1, LRCH4 agus H2B (Fíor 6).
Spreagann IFNα líonra idirghníomhaíochta HLA-A le H2B (H2BFS) agus HMGA1.(A) plota 2D (a ghintear i mbogearraí SIM-XL) a thaispeánann cineálacha éagsúla idirghníomhaíochtaí sa choimpléasc H2B-HLA-A-HMGA1: idirnasc (gorm), idirnasc (dearg) agus nasc aonair (dubh)..Tá dathchódaithe32 ar fhearainn a bhfuil féiniúlachtaí difriúla acu: H2B (histone; 2–102) agus MHC-I (MHC_1; 25–203, grúpa C1; 210–290 agus MHC_I_C; 337–364).Socraíodh an tairseach tras-naisc ag 3.5.Léiríonn ceapacha ponc suímh idirghníomhaíochta HLA-A le H2B (B) agus HMGA1 (C), chomh maith le suíomhanna idirghníomhaíochta K nó S idir an dá pheptídí.San fhigiúr, socraítear an tairseach scór tras-naisc go 3.0.(D) Caidrimh idir próitéiní a léirítear i struchtúir na próitéiní H2B, HLA-A, agus HMGA1 sa chlár PyMOL.Múnlaíodh na struchtúir seo trí úsáid a bhaint as freastalaí Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) agus ba iad na struchtúir teimpléid do na próitéiní H2B, HLA-A agus HMGA1 ná 1kx552, 1kj349 agus 2eze55, faoi seach.
Spreagann IFNα líonra idirghníomhaíochta HLA-A le H2B (H2BFS), MDN1 agus LRCH4.(A) Trasnaisc ionmhóilíneacha (dearg) agus idirmhóilíneacha (gorm) curtha i láthair ar léarscáil idirghníomhach 2D (a ghintear i mbogearraí SIM-XL) le MDN1 arna léiriú mar chiorcal.Socraíodh an tairseach tras-naisc ag 3.5.Tá dathchódaithe32 ar fhearainn d’fhéiniúlachtaí éagsúla: H2B (histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, grúpa C1; 210–290 agus MHC_I_C; 337–364) agus LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) agus CH (535–641)).(B) Caidrimh idir próitéiní a léirítear i struchtúir na próitéiní H2B, HLA-A, LRCH4, agus MDN1 sa chlár PyMOL.Múnlaíodh na struchtúir seo trí úsáid a bhaint as freastalaí Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) le struchtúir teimpléid 1kx552, 1kj349, 6hlu62 agus 6i2665 do na próitéiní H2B, HLA-A, LRCH4 agus MDN1, faoi ​​seach.Ceapacha ponc a thaispeánann suíomhanna idirghníomhaíochta K nó S do HLA-A le H2B (C), LRCH4 (D), agus MDN1 (E).Maidir le ceapacha, socraíodh an tairseach scóir tras-naisc go 3.0.
Chomh maith le sláine an genome a chothabháil, tá baint ag histone H2B freisin le rialáil trascríobh.Is éard atá sa phróitéin H2B ná fearann ​​​​histone lárnach (HFD) atá déanta ag trí α-helices scartha le lúb agus eireaball C-críochfort 41,52.Tarlaíonn an chuid is mó den idirghníomhaíocht le H2B sa helix α1, a sholáthraíonn trimerization leis an heitrisiméir HFD (Fíor 5A, B).Cé go bhfuil baint ag lísíní le ceangal DNA, is suíomhanna malartacha aicéitilithe nó meitilation iad roinnt lísíní freisin.Mar shampla, níl baint ag iarmhair K43, K46, agus K57 ó H2B le ceangal díreach DNA, ach is spriocanna iad le modhnuithe éagsúla iar-thscríbhinne53.Mar an gcéanna, féadfaidh iarmhair K44, K47, agus K57 i H2B ról eile a imirt i láthair IFNα, lena n-áirítear idirghníomhaíochtaí le próitéiní eile (Fíor 5 A, B).Ina theannta sin, gníomhaíonn an histone extrachromosomal H2B an freagra imdhíonachta i gcineálacha cille éagsúla, ag gníomhú mar bhraiteoir citosólach chun blúirí DNA dúbailte-shnáithe (dsDNA) a dhíorthaítear ó oibreáin ionfhabhtaíocha nó ó chealla damáiste54 a bhrath.I láthair víris DNA, chuir ídiú H2B bac ar tháirgeadh IFN-β agus fosfarylation STAT154.Is eol freisin go ngluaiseann H2B isteach agus amach as an núicléas níos tapúla ná croí-histones eile54.Breathnaíodh idirghníomhaíochtaí H2B le MDN1 agus LRCH4 freisin i samplaí neamhchóireáilte roghnaithe.Fuaireamar amach go ndearna HLA-A idirghníomhú le H2B i ngach ceann de na trí shampla cóireáilte le IFNα agus in aon athshampla neamhchóireáilte.Léiríonn na sonraí seo ról H2B i bhfeidhm fiseolaíoch mhalartach atá neamhspleách ar rialachán tras-scríbhinne.
Sainaithníodh HMGA1 (grúpa ard-soghluaisteachta AT-Hook 1), núicléapróitéin beag atá saibhir i aimínaigéid a chothaíonn galair, i gcomhar le HLA-A.Tá eireaball C-críochfort aigéadach aige agus trí DBD ar leith ar a dtugtar crúcaí AT toisc go gceanglaíonn siad le mion-groove an réigiúin saibhir AT i dsDNA55,56.Is é is cúis leis an gceangal seo ná lúbann nó dírítear an DNA, rud a ligeann do fhachtóirí trascríobh canónacha teacht ar a seicheamh comhaontaithe.Creidtear go bhfuil baint ag eireaball C-críochfort in idirghníomhaíochtaí próitéine-próitéine agus in earcú fachtóirí trascríobh, ós rud é nach bhfuil mutants scriosta críochfoirt C in ann an trascríobh a thionscnamh57.Ina theannta sin, tá go leor suíomhanna fosfarylation caomhnaithe san fhearann ​​seo ar a dtugtar foshraitheanna do kinases 58 .Thugamar faoi deara idirghníomhaíochtaí HLA-A agus H2B le HMGA1 lasmuigh den fhearann ​​C-críochfort, rud a thugann le tuiscint go n-úsáidtear an fearann ​​C-críochfort go príomha le haghaidh ceangailteach fachtóir trascríobh (Fíor 5 A, C).Bíonn próitéiní HMGA in iomaíocht le histone H1 maidir le ceangal le DNA cuibheora, rud a mhéadaíonn inrochtaineacht57.Ar an gcaoi chéanna, is cosúil go n-idirghníomhaíonn HMGA le histone H2B feadh an DNA nascóra i gcomórtas le histone H1.Spreagann HMGB1 léiriú HLA-A, -B, agus -C i gcealla dendritic, as a dtagann a ngníomh59, ach níor tuairiscíodh idirghníomhaíocht idir HMG agus HLA roimhe seo.Fuaireamar amach go n-idirghníomhaíonn HMGA1 leis na fearainn α1 agus α3 de HLA-A, agus an chuid is mó de na hidirghníomhaíochtaí lasmuigh dá 3 DBD (Fíor 5A,C).Inár lámha, fuarthas go raibh HLA-A logánaithe sa núicléas (sonraí nach bhfuil léirithe), agus ós rud é go bhfuil H2B agus HMGA1 i láthair sa núicléas freisin, is dócha go dtarlaíonn an idirghníomhaíocht seo sa núicléas.Léirítear aschuir shonracha arna dtomhas idir H2B, HLA-A, agus HMGA1 i bhFíor 5D.
Tarlaíonn an chuid is mó idirghníomhaíochtaí HLA-A le próitéiní eile laistigh dá fhearann ​​α1 agus α2 agus an fearann ​​​​C-críochfort neamhord (Fíor 6).I gceann de na samplaí seo, fuaireamar amach go n-idirghníomhaíonn HLA-A leis an eireaball N-críochfort neamhord de LRCH4 (Fíor 6A, D).Rialaíonn LRCH4 gníomhachtú TLR4 agus ionduchtú cítocín LPS, agus mar sin modhnaítear an freagra imdhíonachta dúchasach60,61.Próitéin membrane is ea é a bhfuil naoi n-athchraoladh saibhir leucine (LRRanna) agus móitíf homaleolaíochta calmodulin (CH) ina ectodomain, agus fearann ​​trasmembrane (TMD) 60 , 62 , ina dhiaidh sin.Tuairiscíodh go ndéanann fearainn CH idirghabháil a dhéanamh ar idirghníomhaíochtaí próitéine-próitéine 60 .Tá stráice de thart ar 300 aimínaigéid idir na fearainn LRR agus CH sách inrochtana ach tá sé neamhord.Bunaithe ar fheidhm na réigiún neamhord mar idirghabhálaithe líonraí próitéine-próitéin agus iompar soithíoch 63 , fuaireamar amach go dtarlaíonn formhór na n-idirghníomhaíochtaí próitéine i réigiúin neamhord.Dáileadh idirghníomhaíochtaí le MDN1 ar fud fad na próitéine, lena n-áirítear na fearainn LRR1, LRR6, CH, agus réigiúin randamach, agus H2B ceangailte go príomha leis an bhfearann ​​​​CH (Fíor 6 A, B).Go háirithe, níor chuimsigh aon cheann de na hidirghníomhaíochtaí an TMJ, rud a thugann le tuiscint go bhfuil sainiúlacht an chur chuige CLMS (Fíor 6A, B).
Sainaithníodh MDN1 freisin mar chuid de líonra próitéine HLA-A (Fíor 6A).Baineann sé leis an teaghlach AAA próitéiní (ATPases a bhaineann le gníomhaíochtaí éagsúla).Is é seo an fearann ​​​​AAA N-críochfort céanna a eagraíonn sé isteach i bhfáinne heicsidheachúlach agus a thógann an fachtóir tionóil ón bhfo-aonad ribosómach 60S 64.dealraitheach go bhfuil sé cosúil le dynein64,65,66.Ina theannta sin, leantar an réigiún saibhir Asp/Glu ag an bhfearann ​​​​MIDAS (suíomh spleách ian miotail).Mar gheall ar an méid mór MDN1 (thart ar 5600 aimínaigéid) agus a homaleolaíocht teoranta le próitéiní dea-staidéar, is beag atá ar eolas faoina struchtúr agus a fheidhm i ndaoine.D'aithníomar HLA-A, H2B, agus LRCH4 mar chomhpháirtithe ceangailteacha MDN1 agus nochtamar a dtreoshuíomh mar choimpléisc próitéine i PyMol (Fíor 6 A, B).Idirghníomhaíonn na trí phróitéin seo leis an bhfearann ​​​​AAA, an fearann ​​nascóirí cosúil le dynein, agus b'fhéidir an fearann ​​MIDAS MDN1.I dtuarascáil roimhe seo, d'aithin íonú cleamhnais próitéiní baoite MDN1 mar phróitéin a bhaineann le histone H2B67.Ina theannta sin, thuairiscigh staidéar le déanaí freisin ar idirghníomhaíocht idir MDN agus HLA-B i gcealla HCT116 ag baint úsáide as mais-speictriméadracht íonaithe cleamhnais, ag tacú lenár dtorthaí68.Tugann sainaithint an choimpléasc seo i samplaí atá cóireáilte ag IFNα le fios go bhfuil ról ag MDN1 i gcomharthú interferon.
Toisc go bhfuil géinte HLA thar a bheith ilmorphic, bhaineamar léamh as seicheamhú le mapáil HLA-A, -B, agus -C ó shonraí seicheamhaithe RNA de chealla Flo-1 (sonraí nach dtaispeántar).Léirigh seichimh peptide a bhí comhsheasmhach leis an léamh seicheamhaithe difríochtaí suntasacha idir HLA-A, -B, agus -C i réigiúin ina raibh peiptídí tras-nasctha suite i HLA-A (Fíor S3).Ina theannta sin, níor thugamar faoi deara trasnascadh próitéin-go-próitéin idir móilíní HLA-B/C le próitéiní H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.Tugann sé seo le tuiscint go bhfuil an idirghníomhaíocht próitéine a aimsítear idir HLA-A, MDN1, LRCH1 agus HMGA1 sonrach do HLA-A.Ina theannta sin, léirigh anailís próitéamaíoch ar shamplaí neamh-crosslinked (Tábla S4) go bhfuil clúdach seicheamh níos airde ag HLA-A i gcomparáid le HLA-B nó HLA-C.Bhí na peiptídí a aithníodh do HLA-A ard i ndéine i samplaí cóireáilte IFNα agus neamhchóireáilte.
Chun a chinntiú nár tharla na hidirghníomhaíochtaí a aithníodh anseo mar gheall ar thrasnascadh neamhshonrach de dhá phróitéin i ngaireacht spásúlachta, dheimhnigh muid a thuilleadh dhá fhachtóir idirghníomhaíochta HLA-A nua trí thástálacha comh-imdhíonachta a dhéanamh.Braitheadh ​​idirghníomhaíochtaí HLA-A le MDN1 agus H2B endogenous i gcealla Flo-1 cóireáilte IFNα agus neamhchóireáilte (Fíor 7, Fíor S4).Dhearbhaíomar go raibh HLA-A gafa ag H2B sna imdhíonprecipitates agus go raibh an comhlachas seo mar gheall ar chóireáil IFNα ós rud é go raibh HLA-A as láthair sna samplaí inmunprecipitate ó chealla neamhchóireáilte (Fíor 7A).Mar sin féin, tugann ár sonraí le fios go rialaíonn IFNα go difreálach ceangailteach HLA-A le H2B agus MDN1.Cothaíonn IFNα comhlachas idir H2B agus HLA-A, ach laghdaíonn sé a chomhlachas le MDN1.Fuaireamar amach go raibh baint ag MDN1 le HLA-A i rialuithe, agus laghdaigh cur leis IFNα an idirghníomhaíocht seo neamhspleách ar ionduchtú MDN1 ag IFNα (Fíor 7B, C).Ina theannta sin, ghabh immunoprecipitation HLA-A H2B i gcealla A549 (Fíor S4), le tuiscint go bhfuil an idirghníomhaíocht seo neamhspleách ar chineál cille.Nuair a chuirtear le chéile iad, tacaíonn na torthaí seo le hidirghníomhaíochtaí idirghabhálaithe HLA-A le H2B agus MDN1.
Comh-íonaíonn HLA-A H2B agus MDN1.Rinneadh imdhíon-bhlotaí ionadaíocha H2B (A) agus MDN1 (B) a imdhíon-réamhshamhlú ó chealla Flo-1 atá cóireáilte le IFNα agus rinneadh iad a iniúchadh le haghaidh na n-antasubstaintí sonraithe.Baineadh úsáid as luchóg agus coinín IgG mar rialú diúltach.(C) Léirítear méideanna coibhneasta (ionchur) antaiginí éagsúla ag imdhíon-bhlotaí a ndearnadh iniúchadh orthu i gcoinne antasubstaintí léirithe, baineadh úsáid as β-actin mar rialú luchtaithe.
Imscrúdaíodh airíonna struchtúracha ceann de na líonraí tras-nasctha an-iontaofa arna dtionscnamh ag interferon, H2B-HLA-A-HMGA1.D’úsáideamar samhaltú dinimic mhóilíneach mar chur chuige eile chun dinimic chomhfhoirmiúil na bpróitéiní a bhaineann leis an gcoimpléasc seo a thuiscint (Fíor 8).Tugann tátail ó na sonraí CLMS le fios go bhféadfadh comhréireanna éagsúla a bheith ann de na próitéiní H2B, HLA-A, agus HMGA1.Mar sin, múnlaíodh na coimpléisc ionchasacha seo a leanas i meán tuaslagóir: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, agus H2B-HLA-A-HMGA1.Mhol scáileán tosaithe próitéine-phróitéine a d'úsáid an pacáiste MOE (Timpeallacht Mhóilíneach Oibriúcháin; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Québec, Ceanada) comhréireachtaí féideartha atá difriúil idir na próitéiní seo (Fig. 8A).Léirigh léirshamhlú ar an gcoimpléasc próitéine dug roinnt idirghníomhaíochtaí agus comhréireachtaí féideartha (Fíor 5A, 8).Mar sin, taispeántar comhfhoirmiú féideartha amháin i bhFíor 8A (le tras-naisc lipéadaithe) agus rinneadh meastóireacht bhreise air ag baint úsáide as an bpíblíne samhaltaithe MD.Ina theannta sin, leagann ceangal H2B nó HMGA1 le HLA-A béim ar an gcleamhnas níos airde de H2B do HLA-A (Fíor 8A).
Dinimic chomhréiteach líonraí féideartha idir na coimpléisc H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A, agus H2B-HLA-A-HMGA1.(A) Is éard atá sa phainéal ar chlé ná léarscáil 2D (a ghintear i mbogearraí SIM-XL) de chrosnaisc ionmhóilíneacha (dearg) agus idirmhóilíneacha (gorm) (scoith trasnasc socraithe go 3.5).Ina theannta sin, déantar iarmhair tras-nasctha a shainaithnítear a lipéadú ar struchtúir na bpróitéiní H2B, HLA-A, agus HMGA1.Baineadh comhréireanna gaolmhara na bpróitéiní seo trí úsáid a bhaint as an bpíblíne dugála a cuireadh i bhfeidhm sa phacáiste MOE.Taispeánann an painéal ar chlé íochtair na comhréireanna éagsúla féideartha de na coimpléisc H2B-HLA-A agus HMGA1-HLA-A le cleamhnachtaí éagsúla ceangailteach próitéine-próitéin (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Diall caighdeánach (RMSD) de shuíomhanna adamhach (gan adaimh hidrigine a áireamh) do gach struchtúr próitéine.(C) Idirghníomhaíochtaí bannaí hidrigine idirmhóilíneacha próitéine-próitéine ó choimpléisc insamhlaithe éagsúla ag cur san áireamh idirghníomhaíochtaí sonracha ar fad iad ≥ 10 ns.Socraíodh an t-achar scoite deontóra-ghlacadóir h-bhann go 3.5 Å, agus socraíodh uillinn scoite an deontóra-H-ghlacadóir go ≥ 160°–180°.(D) Iarmhair lipéadaithe a fhoirmíonn idirghníomhaíochtaí próitéine-HLA-A lena gcomhpháirtithe faoi seach, a chuimsíonn ≥ 20 ns, a bhaintear as coimpléisc chaocha HLA-A-H2B agus HLA-A-HMGA1.Is ionann struchtúir phróitéin agus meánstruchtúr 100 ns MDS.(E) Idirghníomhaíochtaí idir coimpléisc HLA-A-H2B agus HLA-A-HMGA1 i gcomparáid le hidirghníomhaíochtaí arna rianú ag insamhalta H2B-HLA os cionn 100 ns bunaithe ar shuíomh idirghníomhaíochta K nó S idir an dá pheptídí.Coimpléisc /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Socraíodh an luach tairsí le haghaidh meastóireachta ar thrasnaisc go 3.0, agus cuireadh idirghníomhaíochtaí sonracha ó MDS ag cur ≥ 10 ns san áireamh.Rinneadh struchtúir phróitéin a léirshamhlú ag baint úsáide as pacáistí BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, SAM) agus an Timpeallacht Oibriúcháin Mhóilíneach (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Québec, Ceanada).
Léirigh cobhsaíocht mhóilíní HLA-A le himeacht ama (diall caighdeánach; RMSD nó diall caighdeánach; RMSF) gur chobhsaigh láithreacht próitéiní H2B nó HMGA1 sna coimpléisc HLA-A (Fíor 8B, Fíor S5).Ceanglaíonn próitéin HMGA1 go docht le suíomh B2M HLA-A, rud a fhágann cobhsaíocht aimínaigéid HLA-A i gcoimpléasc HLA-A-HMGA1 nó H2B-HLA-A-HMGA1 (Fíor 8B, Fíor S5).go háirithe, fuarthas amach nach raibh iarmhair HLA ~60-90 agus ~180-210 chomh solúbtha i láthair H2B (FIG. 8B).Léirigh H2B agus HMGA1 ceangal níos fearr le HLA-A sa choimpléasc H2B-HLA-A-HMGA1 i gcomparáid le ceangailteach HLA-A le H2B nó HMGA1 amháin (Fíor 8C, D; Tábla S5).Tagann iarmhair a bhfuil baint acu le nascáil hidrigine (ardáitíocht mhúnlaithe MD ≥ 10 ns) i gcomhthráth le suíomhanna idirghníomhaíochta CLMS (iarmhair K nó S) sa choimpléasc, rud a thugann le tuiscint go bhfuil na hidirghníomhaíochtaí a shainaithin CLMS an-iontaofa.Iontaofacht (Fíor 8E ).I samhaltú CLMS agus MD, fuarthas amach go raibh iarmhair HLA-A idir thart ar 190-210 agus thart ar 200-220 aimínaigéid ina gceangal H2B agus HMGA1, faoi seach (FIG. 8E).
Cruthaíonn idirghníomhaíochtaí próitéine-próitéin líonraí struchtúracha dinimiciúla a dhéanann idirghabháil ar chumarsáid incheallach mar fhreagra ar spreagthaigh áirithe.Toisc go n-aimsíonn go leor cineálacha cur chuige próitéamaíochta athruithe ar leibhéal staide seasta foriomlán próitéine, éilíonn dinimic idirghníomhaithe próitéine-próitéine uirlisí breise chun comhéadain cheangailteach a ghabháil, agus is uirlis amháin den sórt sin é CLMS.Is líonra cítocine é an córas comharthaíochta interferon a ligeann do chealla freagairt do raon comharthaí pataigineacha comhshaoil ​​​​agus intreacha paiteolaíocha, as a dtagann ionduchtú fo-thacair de phróitéiní inducite interferon.Chuireamar CLMS i bhfeidhm chun a fháil amach an bhféadfaí idirghníomhaíochtaí núíosacha próitéine-próitéin a shainaithint i measc painéal próitéiní a tharchuirtear le interferon.Baineadh úsáid as anailís tras-nasctha próitéine domhanda i múnla cille Flo-1 a fhreagraíonn do interferon chun coimpléisc próitéine a ghabháil.Ceadaíonn eastóscadh peptídí tryptic ó chealla neamh-trasnasctha agus tras-nasctha do chomhaireamh peptide, saibhriú cosáin, agus dáileadh fad peptide le déine LFQ sainithe.Aithníodh próitéiní canónacha in-inducite mar rialú inmheánach dearfach, agus breathnaíodh adduct tras-nasctha idirmhóilíneacha agus ionmhóilíneacha nua de phróitéiní canónacha in-inducite interferon mar MX1, UP18, OAS3 agus STAT1.Tá iniúchadh déanta ar ghnéithe agus ar idirghníomhaíochtaí struchtúracha éagsúla i limistéir feidhme.
Braitheadh ​​idirghníomhaíocht idir HLA-A, MDN1 agus H2B trí imdhíonadh i gcealla Flo-1 agus A549 cóireáilte agus neamhchóireáilte le IFNα.Léiríonn ár dtorthaí go bhfuil coimpléisc HLA-A le H2B ag brath ar IFNα.Is bealach suimiúil í ár gcuid oibre chun tuilleadh iniúchta a dhéanamh ar chomhlonnú an dá choimpléasc seo.Bheadh ​​​​sé suimiúil freisin cur chuige CLMS a leathnú chuig painéal línte cille chun idirghníomhaíochtaí próitéine interferon-idirmheánaithe neamhspleácha cille a aithint.Mar fhocal scoir, d'úsáideamar samhaltú MD mar chur chuige eile chun tuiscint a fháil ar dhinimic chomhfhoirmiúil na bpróitéiní a bhí i gceist sa choimpléasc H2BFS-HLA-A-HMGA1, a rianaigh traschainteanna ionmhóilíneacha agus idirmhóilíneacha.Tugann tátail ó na sonraí CLMS le fios go bhféadfadh comhréireanna éagsúla a bheith ann do phróitéiní H2BFS, HLA-A, agus HMGA1.Léirigh na comhréireachtaí éagsúla a d'fhéadfadh a bheith ann idir na coimpléisc próitéin dhug seo go leor idirghníomhaíochtaí cosúil leis na cinn a breathnaíodh sa tacar sonraí CLMS.Is é ceann de phríomhláidreachtaí ár modha ná go gceadaíonn sé géinte thar a bheith idirghníomhaitheacha mar HLA a aithint go héasca, agus mar sin beidh sé suimiúil staidéar a dhéanamh ar idirghníomhaíochtaí próitéiní HLA haplotype-shonracha atá deacair ar shlí eile staidéar a dhéanamh orthu.Le chéile, léiríonn ár gcuid sonraí gur féidir CLMS a úsáid chun ár dtuiscint ar líonraí comharthaíochta a tharchuirtear le hinterferon a leathnú agus chun bonn a sholáthar chun staidéar a dhéanamh ar chórais idircheallacha níos casta i micri-thimpeallacht an siadaí.
Fuarthas cealla Flo-1 ó ATCC agus coinníodh iad i DMEM (Gibco) arna bhforlíonadh le 1% peinicillin/streiptimícin (Invitrogen), 10% séiream bó féatais (Gibco) agus stóráilte ag 37°C agus 5% CO2.Goir.Méadaíodh cealla go cumar 70-80% sular cuireadh cóireáil orthu le IFNα14 (déanta ag Áis Táirgthe Próitéin Dhún Éideann).Ceannaíodh gach ceimiceán agus imoibrí eile ó Sigma Aldrich mura sonraítear a mhalairt.
Saothraíodh cealla Flo-1 i bplátaí 6-tobair agus an lá dár gcionn cuireadh cóireáil ar na cealla le 10 ng/ml IFNα14 ar feadh 24 uair go dtí thart ar 80% de chomhthionchar.Níodh cealla trí huaire le PBS agus ligeadh iad le DSS úrullmhaithe (Thermo Fisher Scientific) (tuaslagtha i DMSO) i PBS ar feadh 5 nóiméad ag 37 ° C. go dtí tiúchan deiridh 0.5 mM.Cuireadh PBS in ionad imoibriú trasnasctha an DSS agus múchadh an DSS iarmharach trí 20 mM Tris (pH 8.0) a chur leis i PBS ar feadh 15 nóiméad ag 37°C.Bailíodh cealla trí scríobadh agus bailíodh iad i bhfeadáin cheangailteach íseal (Axygen).
Lísíodh an millíní cille le 300 µl de mhaolán lí úiré (8 M úiré, 0.1 M Tris, pH 8.5) ar feadh 30 nóiméad ag teocht an tseomra le croitheadh ​​ó am go chéile.Rinneadh gach céim lártheifneoraithe ag 14,000 xg ag 8°C.Lártheifneoir an lysate ar feadh 10 nóiméad agus aistrigh an comhshnámh chuig feadán nua.Rinneadh na cáithníní soiléire a bhí fágtha a thuaslagadh i 150 μl den dara maolán lysis (2 M úiré, 2% (w / v) SDS (sulfáit dodecyl sóidiam)) ar feadh 30 nóiméad nó níos mó go dtí go bhfuarthas tuaslagán uiscí aonchineálach.Rinneadh an lysate a lártheifneoiriú ar feadh 20 nóiméad agus meascadh an súiteán leis an lysate a fuarthas sa chéim roimhe sin.Rinneadh measúnú ar thiúchan próitéine ag baint úsáide as an Measúnacht Micrimhilseogra BCA (Thermo Fisher Scientific) de réir threoracha an déantóra maidir le nósanna imeachta micreaphláta.Reoiteadh na samplaí go tapa i nítrigin leachtach agus stóráiltear iad ag -80 °C.
Próiseáladh thart ar 100 μg de phróitéin tras-nasctha intuaslagtha ag baint úsáide as prótacal ullmhaithe sampla scagacháin modhnaithe (FASP) mar a thuairiscigh Wisniewski et al.69 Go hachomair, tá an phróitéin trasnasctha le 200 µl de mhaolán úiré (8 M úiré i 0.1 M Tris, pH 8.5), vortexed agus leath.Rinneadh gach céim lártheifneoraithe ag 14,000 xg ag 25°C.Aistríodh an chéad leath den lysate próitéin tras-nasctha go gléas scagaire lártheifeacha 10 kDa Microcon atá feistithe le membrane Ultracel-10 (Merck), agus ina dhiaidh sin lártheifneoiriú ar an scagaire ar feadh 25 nóiméad.Ansin cuir an dara leath den phróitéin leis an scagaire agus déan na céimeanna céanna arís.Rinneadh aisghabháil próitéine trí 100 μl de hidreaclóiríd fosfín 17 mM tris(2-carboxyethyl) (TCEP) a chur leis i maolán úiré.Tosaíodh an t-aisghabháil ar theirm-mheascán ag 600 rpm ar feadh 30 nóiméad ag 37°C.Ina theannta sin, lártheifneoiríodh an colún agus alkylated an próitéin tras-nasctha laghdaithe ag baint úsáide as 100 μl de iodoacetamide 50 mM i maolán úiré.Rinneadh an t-imoibriú alkylation ag teocht an tseomra ar feadh 20 nóiméad sa dorchadas.Rothlaigh an colún, nigh ballaí an cholúin 3 huaire le maolán úiré 100 µl, agus ansin lártheifneoir.Rinneadh an oibríocht chéanna 3 huaire ag baint úsáide as 100 μl de dhécharbónáit amóiniam 100 mM.Roimh trypsinization, cuir ceann nua in ionad an fheadáin bhailithe.Cuir maolán díleá isteach ina bhfuil décharbónáit amóiniam 50 mM agus 1 µl trypsin caolaithe i maolán trypsin (Promega).Coinníodh an cóimheas idir trypsin le próitéin ag thart ar 1:33, agus goraíodh imoibrithe díleá thar oíche ag 37 ° C. i seomra tais.Cuireadh an peiptíd tras-nasctha ar ceal ón scagaire trí lártheifneoiriú ar feadh 25 nóiméad.Feabhsaíodh aisghabháil peptide trí 50 μl de 0.5 M NaCl a chur leis an scagaire, agus lártheifneoiriú ina dhiaidh sin ar feadh 25 nóiméad.
Baineadh úsáid as colúin C18 Micrimhiliúcháin (Gaireas Harvard) chun peiptídí tripteacha tras-nasctha a dhíshalannú tar éis an phrótacail a ndearna Bouchal et al.70 cur síos air le mionathruithe.Go hachomair, cuireadh colúin casadh C18 i ngníomh le trí níochán d'aigéad formach 0.1% (FA) in aicéatóintríle (AcN) (Merck) agus dhá níocháin de 0.1% FA.Bhí an colún hiodráitithe le 0.1% FA ar feadh 15 nóiméad.Luchtaigh samplaí isteach i gcolúin casadh agus nigh 3 huaire le 0.1% FA.Cuireadh na peiptídí díshaillte ar ceal go seicheamhach le grádán céim ar chéim ag baint úsáide as ACN 50%, 80% agus 100% i 0.1% FA.Triomaíodh na samplaí i dtiúchantóir SpeedVac Plus (Eppendorf) go dtí gur imigh an leacht iarmharach go hiomlán.Díscaoileadh na peptídí eluted i 100 μl d'aigéad trifluoroacetic 0.08% i 2.5% AcN agus tomhaiseadh na tiúchain ar NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Instealladh isteach sa chóras LC-MS/MS thart ar 1 µg de pheptíde tras-nasctha in aghaidh an tsampla.
Scaradh peptídí tras-nasctha ar chóras UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) atá ceangailte le mais-speictriméadar Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).Bailíodh peiptídí tras-nasctha ar cholún gabhála C18 300 µm ID, 5 mm ar fhad µ-réamhcholún C18 pacáilte le sorbent C18 PepMap100 agus 5 µm PepMap sorbent (Thermo Scientific).Luchtaigh an sreabhadh caidéil socraithe ag 5 µl/nóim 0.08% d'aigéad trifluara-aicéiteach tuaslagtha i 2.5% AcN.Scaradh peptídí tras-nasctha ar cholún shilice comhleáite anailíseach le trastomhas istigh de 75 μm agus fad 150 mm, líonadh le sorbent PepMap 2 μm (Thermo Scientific).Bhí céimeanna soghluaiste A agus B comhdhéanta de 0.1% FA in uisce agus 0.1% FA in aicéataitrile, faoi seach.Tosaíonn an grádán ag 2.5% B agus méadaíonn sé go líneach go 40% B thar 90 nóiméad, ansin go 90% B thar an gcéad 2 nóiméad eile.Coinníodh comhdhéanamh na céime soghluaiste ag 90% B ar feadh 10 nóiméad agus ansin laghdaigh sé go líneach go 2.5% B thar 2 nóiméad.Bhí an colún cothromaithe ag 2.5% B ar feadh 8 nóiméad roimh an gcéad timthriall eile.Rinneadh peiptídí tras-nasctha a baineadh as an gcolún anailíseach a ianú i bhfoinse ianaithe nana-leictreaspré (NSI) agus a instealladh isteach i mais-speictriméadar Exploris 480 (Thermo Scientific).
D'oibrigh mais-speictriméadar Orbitrap Exploris 480 sa mhodh comhghaolaithe sonraí dearfacha.Rinneadh scanadh iomlán i mód na coda ag taifeach 120,000 le socruithe raoin ó m/z 350 Th go m/z 2000 Th.Socraíodh sprioc normalaithe an AGC ag 300% le huas-am ionchuir de 50m.Tá buaicbhrath monoisotopic bunaithe do pheptídí.Socraítear an paraiméadar um mhaolú sriantachta fíor má aimsítear róbheagán réamhtheachtaithe.Socraíodh íos-neart ianach an réamhtheachtaithe go 5.0e3 agus áiríodh stáit luchta réamhtheachtaithe suas go +8 sna turgnaimh.
Socraíodh an t-am timthriall idir mórscananna i mód comhghaolaithe sonraí go 2.5 soicind.Socraíodh eisiamh mais dinimiciúil go 20 s tar éis an chéad ilroinnt ar an ian réamhtheachtaithe.Socraíodh an fhuinneog leithlisithe réamhtheachtaithe go 2 Th.Roghnaíodh an cineál fuinnimh imbhuailte normalaithe le mód fuinnimh imbhuailte fosaithe i scanadh MS/MS atá ag brath ar shonraí.Fuinneamh imbhuailte socraithe go 30%.Socraíodh an réiteach Orbitrap go 15,000 agus sprioc an AGC go 100%.Socraítear an t-am uasta insteallta saincheaptha go 60 milleasoicind.
Sula ndéantar an líonra próitéine-próitéine a rianú i samplaí tras-nasctha, rinneamar próiseáil ar na comhaid amh ag baint úsáide as an bpacáiste MaxQuant (leagan 1.6.12.0) 26,27 chun peiptídí / próitéiní inrianaithe a aithint sna samplaí.Ina theannta sin, rinneadh anailísí próitéamacha comhchosúla ar shamplaí Flo-1 neamh-chroscheangailte a ndearnadh cóireáil orthu agus nár cuireadh cóireáil orthu le IFNα.Cuardaíodh sonraí MS/MS i mbunachar sonraí daonna UniProt (www.uniprot.org) (uaslódáladh 12 Lúnasa, 2020, agus tá 75,093 iontráil) ag baint úsáide as an inneall cuardaigh ionsuite Andromeda27.Rinneadh an cuardach gan sainiúlacht na heinsíme agus modhnuithe éagsúla deamidation (N, Q) agus ocsaídiúcháin (M) a léiriú.Socraíodh lamháltais mais réamhtheachtaithe ag 20 ppm agus iain táirge ag 0.02 Da.Socraíodh an diall tosaigh agus mais uasta go 10 ppm.Socraíodh mais uasta an pheptíde ag 4600 Da agus socraíodh an chosúlacht seicheamh idir 7 agus 25 aimínaigéid (aa).Rinneadh anailís staitistiúil bhreise ag baint úsáide as an gclár Perseus (leagan 1.6.10.45).Ríomhadh an t-ábhar próitéine trí dhéine speictreach an phróitéin (déine LFQ; cainníochtú gan lipéad)27 a normalú agus tiontaíodh na luachanna déine go Log2.Tógadh cnuasach ordlathach próitéiní arna sainaithint ag a ndéine peiptíde ag baint úsáide as an bpacáiste léarscáil pheat (v1.0.12) in R (v 4.1.2).Rinneadh anailís saibhrithe cosáin ag baint úsáide as an mbunachar sonraí cosáin Reactome do phróitéiní cóireáilte le IFNα a bhí níos mó ná ceithre huaire gníomhachtaithe i gcomparáid le samplaí neamhchóireáilte.
Rinneadh sainaithint trasnaisc cheimiceacha ar leith lísín (K) nó serine (S) de choimpléisc próitéine a ndearna LC-MS/MS monatóireacht orthu ag baint úsáide as meaisín aitheantais speictreascópach (SIM-XL) le haghaidh peiptídí tras-nasctha (SIM-XL)29.Ar dtús, rinneadh imscrúdú ar idirghníomhaíochtaí féideartha idir géinte sínithe friotaíochta damáiste DNA (IRDS) a bhaineann le interferon (IFN) ag baint úsáide as an tacar sonraí próitéin IRDS a bhfuil cur síos air i Padariya et al.28.Tá scagadh na gcoinníollacha agus na hathchraolta ar an UniProt daonna iomlán dian ó thaobh ríomha de, agus mar sin tá 75,093 iontráil i mbunachar sonraí iomlán UniProt daonna (www.uniprot.org) (íoslódáil 12 Lúnasa 2020) i gcoinne athchraoltaí arna gcóireáil ag IFNα.Ceann de na scagairí le haghaidh idirghníomhaíochtaí muiníne ard.Leathnaíodh agus tástáladh na hidirghníomhaíochtaí ard-suntasacha seo i ngach athrá agus coinníollacha.
I SIM-XL, baineadh úsáid as DSS don crosslinker (XL) agus socraíodh an t-aistriú meáchain XL agus athrú meáchain modhnú go 138.06 agus 156.07, faoi seach.Breathnaítear ar na suíomhanna imoibrithe trasnasctha seo a leanas: KK, KS agus KN-TERM, gan iain tuairisceora.Socraíodh an dá réamhtheachtaí agus blúire ppm go 20 agus socraíodh tairseach Xrea go 0.15.Measadh go raibh Trypsin go hiomlán sonrach, agus cuireadh modh ilroinnte C-gaiste ardfhuinnimh (HCD) i bhfeidhm.Socraíodh tairseach laghdaithe DB dinimiciúil XCorr agus an líon íosta peptídí le haghaidh laghdú dinimiciúil DB go 2.5 agus 2, faoi seach.Is iad seo a leanas na paraiméadair eile: dóchúlacht mhonaiseatóp agus buaicscoitheadh ​​comhtharlaithe, íosmhéid 4 iarmhar AA in aghaidh an tsnáithe agus uasmhuirear na snáitheanna, agus 3 uasmhéid de scoilteanna caillte.Rinneadh anailís ar na léarscáileanna 2T greamaithe a d’eascair as (SIM-XL) agus baineadh úsáid as an léiriú grafach xQuest28 chun na léarscáileanna 2T a thógáil.Soláthraítear trasnaisc próitéine ar struchtúir próitéine i PyMol (Córas Grafaic Mhóilíneach PyMOL, leagan 2.0 Schrödinger, LLC).
Cruthaíodh struchtúir samhail próitéine ag baint úsáide as an bhfreastalaí Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 ag baint úsáide as na prionsabail a bhaineann le samhaltú homaleolaíochta agus cur i bhfeidhm an “Modh Hidden Markov”.Gineann Phyre2 struchtúir mhúnla bunaithe ar ailíniú seicheamh le struchtúir phróitéin aithnidiúla.Le haghaidh próitéiní H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, agus MDN1, baineadh úsáid as struchtúir teimpléid 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, agus 6i2665.Ina theannta sin, rinneadh struchtúr AlphaFold71 MX1, UBP18 agus ROBO1 a mheas freisin.Rinneadh an struchtúr próitéine a léirshamhlú ag baint úsáide as an bpacáiste BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, SAM) agus an pacáiste Timpeallacht Oibriúcháin Mhóilíneach (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Québec, Ceanada).