347 12.7*1.24mm Feadánra coiled cruach dhosmálta , Meicníocht mhóilíneach de chomhdhlúthú leictreastatach sioncronach agus comhbhailiú α-synuclein agus tau

Go raibh maith agat as cuairt a thabhairt ar Nature.com.Tá tú ag baint úsáide as leagan brabhsálaí a bhfuil tacaíocht CSS teoranta aige.Chun an taithí is fearr a fháil, molaimid duit brabhsálaí nuashonraithe a úsáid (nó Mód Comhoiriúnachta a dhíchumasú in Internet Explorer).Ina theannta sin, chun tacaíocht leanúnach a chinntiú, taispeánann muid an suíomh gan stíleanna agus JavaScript.
Sleamhnáin a thaispeánann trí alt in aghaidh an tsleamhnáin.Bain úsáid as na cnaipí cúil agus seo chugainn chun bogadh tríd na sleamhnáin, nó na cnaipí rialtóra sleamhnáin ag an deireadh chun bogadh trí gach sleamhnán.

347 Sonraíocht Píopa Cruach Dhosmálta

347 12.7*1.24mm Feadán coiled cruach dhosmálta

Trastomhas Lasmuigh: 6.00 mm OD suas go 914.4 mm OD, Méideanna suas le 24” NB ar fáil Feadáin Cruach Ex-stock, Méid OD ar fáil Ex-stock

Raon Tiús Píob SS 347: 0.3mm - 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, etc. (0.5-12mm) Nó méid neamh-rialta a chur in oiriúint de réir mar is gá

Cineál: SS 347 Píopaí gan uaim |Píopaí SS 347 ERW |SS 347 Píopaí Táthaithe |SS 347 Píopaí Déanta |Feadáin CDW SS 347, Píopaí LSAW / Seam-táthaithe / Aththarraingthe

Foirm: SS 347 Píopaí Babhta/ Feadáin, SS 347 Píopaí/ Feadáin Chearnógacha, SS 347 Píob/ Feadáin Dronuilleogacha, SS 347 Feadáin Churtha, Cruth SS 347 “U”, SS 347 Cornaí Cáca Pan, SS 347 Feadáin Hiodrálacha

Fad: Randamach Singil, Randamach Dúbailte & Fad Riachtanach: Deireadh Gnáth, Deireadh Beveled, Treadáilte

Cosaint Deireadh: Caps Plaisteacha |Críochnaigh Lasmuigh: Críochnaigh Scáthán 2B, Uimh.4, Uimh.1, Uimh.8 le haghaidh Píopaí Cruach Dhosmálta, Críochnaigh de réir Riachtanais an chustaiméara

Coinníoll Seachadta: Annealed agus picilte, Snasta, Geal Annealed, Fuar Tarraingthe

Cigireacht, Tuarascálacha Tástála: Deimhnithe Tástála Muileann, EN 10204 3.1, Tuarascálacha Ceimiceacha, Tuarascálacha Meicniúla, Tuarascálacha Tástála PMI, Tuarascálacha Cigireachta Amhairc, Tuarascálacha Cigireachta Tríú Páirtí, Tuarascálacha Saotharlainne Faofa NABL, Tuairisc Tástála Millteach, Tuarascálacha Tástála Neamh-Mhillteacha

Pacáil: Pacáilte i mBoscaí Adhmaid, Málaí Plaisteacha, Stiallacha Cruach Cuachta, nó de réir Iarratais Chustaiméirí

Speisialta: Is féidir Méideanna agus Sonraíochtaí seachas thuas a mhonarú ar iarratas

Raon Méid Píobáin SS 347: 1/2 orlach NB, OD go 24 orlach

ASTM A312 347: Píobán austenític táthaithe gan uaim agus seam díreach atá beartaithe le haghaidh ardteocht agus seirbhís creimneach ginearálta.Ní cheadaítear miotail filler le linn táthú.

ASTM A358 347: Píobán austenític táthaithe le comhleá leictreach le haghaidh seirbhíse creimneach agus/nó ardteochta.De ghnáth ní tháirgtear ach píopa suas le 8 orlach de réir na sonraíochta seo.Ceadaítear miotail líonta a chur leis le linn táthú.

ASTM A790 347: Píobán feirritíteacha/austenític (déphléacsacha) táthaithe gan uaim agus le seam díreach atá beartaithe le haghaidh seirbhíse creimneach ginearálta, le béim ar leith ar fhriotaíocht in aghaidh scoilteadh struis-chreimeadh.

ASTM A409 347: Comhleá leictreacha seam díreach nó bíseach táthaithe píopa balla solais austenític trastomhas mór i méideanna 14" go 30" le ballaí Sch5S agus Sch 10S do creimneach agus/nó ard

ASTM A376 347: Píobán austenític gan uaim le haghaidh feidhmeanna teocht ard.

ASTM A813 347: Píobán austenític aon-réine, singil nó táthaithe dúbailte le haghaidh feidhmeanna creimneach ardteochta agus ginearálta.

ASTM A814 347: Píobán austenític táthaithe fuar-oibrithe le haghaidh teocht ard agus seirbhís creimneach ginearálta.

347H Comhdhéanamh Ceimiceach Píopaí Cruach Dhosmálta

Airíonna Meicniúla Píob 347H Cruach Dhosmálta

Píopaí Cruach Dhosmálta 347H Airíonna Fisiceacha

Gráid Choibhéiseacha do Phíopa Cruach Dhosmálta 347H

Is sainmharc é comhiomlánú alfa-synuclein amyloid (αS) de ghalar Parkinson agus synucleinopathies eile.Le déanaí, tá baint ag an próitéin tau a bhaineann go coitianta le galar Alzheimer le paiteolaíocht αS agus fuarthas amach go bhfuil sé comh-lonnaithe i gcuimsiú saibhir αS, cé go bhfuil meicníocht mhóilíneach comhiomlánú an dá phróitéin fós doiléir.Tuairiscímid anseo go scarann ​​an chéim αS isteach i gcomhdhlútháin leachtacha trí chomhdhlúthú coimpléascach leictreastatach le polaipeiptíde luchtaithe go deimhneach, mar shampla tau.Ag brath ar an gcleamhnas atá ag αS le haghaidh polycations agus ráta ídiú valence an líonra téachtaithe, téann téachtáin faoi gheoiliú tapa nó comhtháthú agus comhiomlánú mall amyloid ina dhiaidh sin.Trí shraith de theicnící bithfhisiceacha chun cinn a chomhcheangal, bhíomar in ann an deighilt chéim leachtach-leachtach αS/Tau a thréithriú agus na príomhfhachtóirí a shainaithint as a n-eascraíonn foirmiú comhiomláin ilchineálach ina bhfuil an dá phróitéin i gcomhdhlúthán próitéin leachtach.
Chomh maith le urranna membrane, is féidir scaradh spásúil i gcealla a bhaint amach freisin trí chomhlachtaí dlúth saibhir próitéine, leachtacha ar a dtugtar comhdhlútháin nó braoiníní bithmhóilíneacha a fhoirmiú, trí phróiseas ar a dtugtar scaradh céime leachtach-leachtach (LLPS).Cruthaítear na braoiníní seo trí idirghníomhaíochtaí ilfhiúsacha ama, de ghnáth idir próitéiní nó próitéiní agus RNA, agus feidhmíonn siad feidhmeanna éagsúla i mbeagnach gach córas beo.Léiríonn líon mór de phróitéiní atá in ann LLP seichimh de chastacht íseal a bhfuil an-neamhord sa nádúr agus i bhfoirmiú comhdhlúthán bithmhóilíneach3,4,5.Léirigh go leor staidéir thurgnamhach nádúr solúbtha, neamhord minic, agus ilfhiúsach na bpróitéiní a chomhdhéanann na comhdhlútháin leachta seo, cé nach bhfuil mórán ar eolas faoi na sainchinntithigh mhóilíneacha a rialaíonn fás agus aibiú na gcomhdhlúthán seo go leibhéal níos soladach. stáit..
Tacaíonn na sonraí nua leis an hipitéis go bhféadfadh LLPS neamhbhuan próitéine-tiomáinte agus braoiníní a chlaochlú go struchtúir dhaingne a bheith ina gconairí ábhartha ceallacha as a dtiocfaidh comhiomláin tocsaineacha dothuaslagtha a fhoirmiú ar minic iad ina sainmharcanna de ghalair degenerative.Tá baint le fada ag go leor próitéiní a bhaineann le neamhord intreach (IDPanna) a bhaineann le LLPS, a bhfuil an-luchtú agus solúbtha acu go minic, le néar-mheathlú tríd an bpróiseas comhiomlánaithe amyloid.Go háirithe, léiríodh go dtéann comhdhlútháin IDP bithmhóilíneacha ar nós FUS7 nó TDP-438 nó próitéiní le fearainn mhóra ar chastacht íseal ar nós hnRNPA19 in aois go foirmeacha glóthacha nó fiú foirmeacha soladacha trí phróiseas ar a dtugtar sreabhánú.cumaisc.chuig trasdul pas soladach (LSPT) mar fheidhm ama nó mar fhreagra ar mhodhnuithe iar-aistrithe áirithe nó sócháin atá suntasach go paiteolaíoch1,7.
IDP eile a bhaineann le LLPS in vivo ná Tau, próitéin neamhord a bhaineann le microtubule a bhfuil a chomhiomlánú amyloid gafa le galar Alzheimer10 ach a bhfuil baint aige le déanaí le galar Parkinson (PD) agus próitéiní núicléacha synaptic eile 11, 12, 13 a bhaineann leo.Léiríodh go ndéanann Tau dícheangal go spontáineach ó thuaslagán/cíteaplasma mar gheall ar idirghníomhaíochtaí leictreastatacha fabhracha14, agus mar thoradh air sin foirmítear braoiníní tau-saibhrithe ar a dtugtar coacervates leictreastatacha.Tá sé tugtha faoi deara freisin gurb é an cineál seo idirghníomhaithe neamhshonracha an fórsa tiomána taobh thiar de go leor comhdhlúthán bithmhóilíneach sa nádúr15.I gcás próitéin tau, is féidir comhiomlánú leictreastatach a fhoirmiú trí chomhiomlánú simplí, ina spreagann réigiúin den phróitéin atá luchtaithe go héagsúil an próiseas scoilte, nó trí chomhiomlánú casta trí idirghníomhú le polaiméirí luchtaithe diúltacha ar nós RNA.
Le déanaí, léiríodh α-synuclein (αS), IDP amyloid atá bainteach le PD agus galair néar-mheathlúcháin eile ar a dtugtar synucleinopathy17,18 le chéile, i samhlacha ceallacha agus ainmhithe19,20 atá comhchruinnithe i gcomhdhlútháin próitéine le hiompar cosúil le sreabhán.Tá sé léirithe ag staidéir in vitro go dtéann αS faoi LLPS trí chomhiomlánú simplí trí idirghníomhaíochtaí hidreafóbach den chuid is mó, cé go n-éilíonn an próiseas seo tiúchain próitéine atá thar a bheith ard agus amanna goir aitíopúla19,21.Is saincheist thábhachtach fós í cé acu an bhfuil na comhdhlútháin ina bhfuil αS a breathnaíodh in vivo déanta ag an bpróiseas seo nó ag próisis eile PLPS.Mar an gcéanna, cé go bhfuil comhiomlánú amyloid αS tugtha faoi deara i néaróin i PD agus synucleinopathies eile, tá an mheicníocht cruinn trína dtéann αS faoi chomhiomlánú amyloid intracellular fós doiléir, toisc nach cosúil go gcuireann ró-eisiúint na próitéine seo tús leis an bpróiseas seo ann féin.Is minic go mbíonn gá le damáiste breise ceallacha, rud a thugann le tuiscint go bhfuil gá le láithreacha ceallacha áirithe nó le micrithimpeallachtaí chun tionóil amyloid αS intracellular a athnúsú.D'fhéadfadh go mbeadh an taobh istigh de chomhdhlútháin phróitéine i dtimpeallacht cheallacha amháin a bhfuil an-seans ann do chomhiomlánú 23 .
Suimiúil go leor, fuarthas amach go comh-localize αS agus tau i inclusions galar tréith i ndaoine le galar Parkinson agus synucleinopathies eile 24,25 agus turgnaimh a tuairiscíodh caidreamh sineirgisteacha paiteolaíocha idir an dá próitéiní 26,27 le tuiscint gaol féideartha idir comhiomlánú αS agus tau i galair neurodegenerative.tinneas.Fuarthas amach go n-idirghníomhaíonn αS agus tau agus go gcuireann siad comhiomlánú a chéile in vitro agus in vivo 28,29 chun cinn agus breathnaíodh comhiomláin ilchineálacha comhdhéanta den dá phróitéin seo in inchinn othar le synucleinopathies 30 .Mar sin féin, is beag atá ar eolas faoi bhunús móilíneach na hidirghníomhaíochta idir αS agus tau agus meicníocht a chomhbhailiúcháin.Tuairiscíodh go n-idirghníomhaíonn αS le tau trí mhealladh leictreastatach idir an réigiún C-críochfort atá luchtaithe go mór-diúltach de αS agus an réigiún lárnach proline-saibhir de tau, atá saibhrithe freisin in iarmhair luchtaithe deimhneach.
Sa staidéar seo, léirímid gur féidir le αS dícheangail go deimhin i braoiníní trí chomhdhlúthú casta leictreastatach i láthair próitéin tau, i gcodarsnacht lena idirghníomhaíocht le polaipeiptídí eile atá luchtaithe go dearfach mar phola-L-lísín (pLK), agus sa phróiseas seo .Feidhmíonn αS mar mhóilín scafall don líonra braoiníní.Tá difríochtaí suntasacha aitheanta againn i bpróiseas aibithe coacervates αS leictreastatach, a bhaineann le difríochtaí i valency agus neart idirghníomhaíocht na próitéiní baint acu leis an líonra coacervate.Suimiúil go leor, thugamar faoi deara comh-chomhiomlánú próitéiní amyloid αS agus tau i coacervates leacht saol fada agus d'aithin roinnt príomhfhachtóirí as a dtagann comh-chomhiomlánú an dá próitéiní i coacervates den sórt sin.Anseo déanaimid cur síos go mion ar an bpróiseas seo, ar meicníocht mhóilíneach féideartha é mar bhonn le comhlonnú dhá phróitéin i gcuimsithe a bhaineann go sonrach le galair.
Tá eireaball C-críochfort an-anionic ag αS ag pH neodrach (Fíor 1a), agus rinneamar hipitéisiú go bhféadfadh sé dul faoi LLPS trí chomhdhlúthú coimpléisc leictreastatacha le móilíní polaipeiptíde neamhord polycationic.D'úsáidamar polai-L-lísín 100-iarmhar (pLK) mar mhóilín múnla tosaigh mar gheall ar a nádúr polaiméire a bhí luchtaithe agus neamhord dearfach ag pH neodrach 32. Ar dtús, dheimhnigh muid go n-idirghníomhaíonn pLK le fearann ​​Ct de αS trí Réiteach NMR speictreascópacht. (Fíor 1b) ag baint úsáide as αS lipéadaithe 13C/15N i láthair cóimheasa molar αS:pLK méadaithe.Léiríonn idirghníomhú pLK le Ct-fearainn αS é féin i suaitheadh ​​​​an t-aistriú ceimiceach agus laghdú ar an buaic-déine sa réigiún seo den phróitéin.Suimiúil go leor, nuair a mheascamar αS le pLK ag tiúchan αS de thart ar.5–25 µM i láthair glycol poileitiléin (5–15% PEG-8) (maolán LLPS tipiciúil: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) chuaigh muid láithreach trí réimse leathan de fhoirmiú próitéin .Breathnaíodh braoiníní ag baint úsáide as micreascópacht fhluaraiseacht (WF) agus geal-réimse (BF) (Fíor 1c).braoiníní 1-5 µm ina bhfuil αS tiubhaithe (a cuireadh leis 1 µM AlexaFluor488-lipéadaithe αS, AF488-αS), is féidir a n-airíonna leictreastatacha a dhíorthú óna fhriotaíocht do 10% 1,6-heacsanediol (1,6-HD) agus a íogaireacht do méadú ar thiúchan NaCl (Fíor 1c).Léirítear nádúr sreabhán cosúil le coacervates an choimpléasc leictreastatach αS/plK ag a gcumas comhleá laistigh de na milleasoicindí ( Fíor. 1 d ).Ag baint úsáide as turbidimetry, rinneamar cainníochtú ar fhoirmiú braoiníní faoi na coinníollacha seo, dheimhnigh muid nádúr leictreastatach an phríomh-idirghníomhaíochta a bhaineann lena cobhsaíocht (Fíor 1e), agus rinneamar measúnú ar éifeacht cóimheasa polaiméire éagsúla ar an bpróiseas LLPS (Fíor 1f).Cé go bhfuil foirmiú droplet faoi deara thar raon leathan de chóimheasa polaiméire, tá an próiseas an-fhabhrach nuair a bhíonn pLK os cionn αS.Breathnaíodh freisin ar LLPanna ag baint úsáide as an ngníomhaire díláithrithe dextran-70 (70 kDa) atá difriúil ó thaobh ceimiceach de nó ag baint úsáide as éagsúlacht formáidí samplacha, lena n-áirítear titeann sleamhnáin ghloine, toibreacha micreaphláta d'ábhair éagsúla, Eppendorf nó ribeadáin Grianchloch.
Léiriú scéimreach de réigiúin éagsúla próitéine sna leaganacha WT-αS agus ΔCt-αS a úsáideadh sa staidéar seo.Taispeántar an fearann ​​amfafatach N-críochfort, an réigiún foirmithe amyloid-amyloid (NAC) hidreafóbach, agus an fearann ​​​​C-críochfort a ghearrtar go diúltach i gorm, oráiste, agus dearg, faoi seach.Taispeántar an léarscáil de WT-αS ar an Muirear Glan In aghaidh Iarmharach (NCPR).b Anailís NMR ar an idirghníomhaíocht αS/pLK in éagmais cnapáin mhacramóilíní.De réir mar a mhéadaíonn tiúchan pLK (taispeántar cóimheasa molar αS:pLK de 1:0.5, 1:1.5, agus 1:10 i solas glas, glas agus dorcha glas, faoi seach).c Coacervate αS/pLK (cóimheas molar 1:10) ag 25 µM (1 µM AF488-lipéadaithe αS nó Atto647N-lipéadaithe pLK le haghaidh íomháú WF) i maolán LLPS (barr) nó forlíonta le 500 mM NaCl (bun 10 ar chlé) nó tar éis % 1,6-hexanediol (1,6-HD; bun ar dheis).Barra scála = 20 µm.d Íomhánna micreascópacha ionadaíocha de chomhleá braoiníní BF de αS/pLK (cóimheas molar 1:10) ag tiúchan 25 μM;Léiríonn saigheada an chumaisc de titeann aonair (saigheada dearg agus buí) isteach i titim nua (saighead oráiste) laistigh de 200 ms).Barra scála = 20 µm.e Scaipeadh solais (ag 350 nm) αS/pLK comhiomlánú i maolán LLPS roimh agus tar éis 500 mM NaCl nó 10% 1,6-HD ag 25 µM αS (N = 3 macasamhlú sampla, meán agus diallas caighdeánach in iúl freisin).f Íomhá BF (barr) agus anailís scaipthe solais (ag 350 nm, bun) ar chomhiomlánú αS/pLK ag 25 μM αS le cóimheas méadaitheach αS:pLK molar (macasamhlú sampla N = 3, meán agus diall caighdeánach léirithe freisin).Barra scála = 10 µm.Léiríonn an barra scála ar íomhá amháin scála na n-íomhánna go léir i bpainéal amháin.Cuirtear sonraí amh ar fáil i bhfoirm comhaid sonraí amh.
Bunaithe ar ár mbreathnuithe ar chomhdhlúthú casta leictreastatach αS/pLK agus ar bhreathnuithe roimhe seo ar αS mar mhóilín cliant den chomhdhlúthán tau/RNA trí idirghníomhú díreach le tau31, rinneamar hipitéisiú go bhféadfadh αS agus tau comhdheighilt leis an tuaslagóir in éagmais RNA. comhdhlúthú.trí choimpléisc leictreastatacha, agus is é αS an scafall próitéine i gcócarvates αS/Tau (féach dáileadh lucht tau i bhFíor 2e).Thugamar faoi deara nuair a bhí 10 μM αS agus 10 μM Tau441 (ina bhfuil 1 μM AF488-αS agus 1 μM Atto647N-Tau, faoi seach) measctha le chéile i maolán LLPS, foirmíodh siad go héasca comhiomláin próitéine ina bhfuil an dá phróitéin, mar a fheictear le micreascópacht WF.(Fíor 2a).Deimhníodh comhlocalú an dá phróitéin sna braoiníní le micreascópacht chomhfhócasach (CF) (Fíor Fhorlíontach 1a).Breathnaíodh iompar den chineál céanna nuair a úsáideadh dextran-70 mar ghníomhaire comhiomlánaithe (Fíor Forlíontach 1c).Trí úsáid a bhaint as PEG nó dextran lipéadaithe FITC, fuaireamar amach go raibh an dá ghníomhairí plódaithe scaipthe go cothrom ar fud na samplaí, rud a léirigh nach raibh deighilt ná comhlachas ann (Fíor Fhorlíontach 1d).Ina ionad sin, tugann sé le tuiscint go gcuireann siad scaradh céime chun cinn sa chóras seo trí éifeachtaí plódaithe macramóilíní, ós rud é gur gníomhaire plódaithe cobhsaí tosaíochta é PEG, mar a fheictear i gcórais LLP eile33,34.Bhí na braoiníní saibhir i bpróitéin seo íogair do NaCl (1 M) ach ní raibh siad íogair do 1,6-HD (10% v/v), ag deimhniú a n-airíonna leictreastatacha (Fíor Forlíontach 2a, b).Deimhníodh a n-iompar sreabhán trí theagmhais chumaisc milleasoicindí a bhreathnú trí úsáid a bhaint as micreascópacht BF (Fíor 2b).
a micreascópacht Comhfhócasach (CF) íomhánna de αS/Tau441 comhacervates i maolán LLPS (10 μM de gach próitéin, 0.5 μM de AF488-lipéadaithe αS agus Atto647N-lipéadaithe Tau441).b Íomhánna ionadaíocha trasnaíochta trasnaíochta difreálach (DIC) d’imeachtaí comhleá braoiníní αS/Tau441 (10 μM do gach próitéin).c Léaráid chéimse bunaithe ar scaipthe solais (ag 350 nm) de Tau441 LLPS (0–15 µM) in éagmais (ar chlé) nó láithreacht (ar dheis) 50 µM αS.Léiríonn dathanna níos teo níos scaipthe.d Scaipeadh éadrom samplaí LLPS αS/Tau441 le tiúchan αS ag méadú (Tau441 ag 5 µM, N = 2–3 athrá sampla mar a léirítear).e Léiriú scéimreach ar roinnt leagan próitéine tau agus réigiúin éagsúla den phróitéin a úsáideadh sa staidéar seo: fearann ​​N-teirminéal (dearg), réigiún saibhir proline (gorm), fearann ​​ceangailteach microtubule (MTBD, aibhsithe in oráiste), agus bíseach péire amyloid-forming.réigiúin filiméid (PHF) atá suite laistigh den MTBD (liath).Taispeántar an léarscáil Glanmhuirir In aghaidh an Iarmhair (NCPR) de Tau441.f Ag baint úsáide as 1 µM AF488-lipéadaithe αS agus Atto647N-lipéadaithe ΔN-, ag baint úsáide as 1 µM AF488-lipéadaithe αS nó ΔCt-αS i láthair ΔNt-Tau (barr, 10 µM in aghaidh an próitéin) nó próitéin K18 (bun) (a) (b) micreagraif de WF comhdhlúite i LLPS nó i maolán K18.Léiríonn na barraí scála in aon íomhá amháin scála na n-íomhánna go léir i bpainéal amháin (20 µm do phainéil a, b agus f).Soláthraítear sonraí amha do phainéil c agus d mar amhchomhaid sonraí.
Chun ról αS sa phróiseas LLPS seo a thástáil, rinneamar imscrúdú ar dtús ar éifeacht αS ar chobhsaíocht bhraoiníní trí nephelometry ag baint úsáide as tiúchan méadaithe NaCl (Fíor 2c).Dá airde an tiúchan salainn sna samplaí ina bhfuil αS, is airde na luachanna scaipthe solais (ag 350 nm), rud a léiríonn ról cobhsaithe αS sa chóras LLPS seo.Is féidir éifeacht chomhchosúil a thabhairt faoi deara tríd an tiúchan αS (agus mar sin an cóimheas αS:Tau441) a mhéadú go dtí thart ar.Méadú 10-huaire i gcoibhneas leis an tiúchan tau (5 µM) (Fíor 2d).Chun a léiriú gur próitéin scafall é αS i coacervates, shocraigh muid imscrúdú a dhéanamh ar iompar an tsóiteáin Tau a bhfuil cur isteach air LLPS, nach bhfuil réigiún N-críochfort a ghearrtar go diúltach (iarmhair 1-150, féach Fíor. 2e) ar a dtugtar ΔNt-Tau.Dhearbhaigh micreascópacht agus nephelometry WF nach ndearna ΔNt-Tau féin LLPS (Fíor 2f agus Fíor Forlíontach 2d), mar a tuairiscíodh roimhe seo 14. Mar sin féin, nuair a cuireadh αS le réitigh scaipthe den leagan teasctha Tau seo, bhí an próiseas LLPS go hiomlán athchóirithe le dlús braoiníní gar do dhlús braoin na dtuaslagán lánmhéide de Tau agus αS faoi choinníollacha comhchosúla agus tiúchan próitéine.Is féidir an próiseas seo a thabhairt faoi deara freisin faoi choinníollacha plódaithe macromóilíní íseal (Fíor Forlíontach 2c).Léiríodh ról an réigiúin C-críochfort αS, ach ní a fhad iomlán, sa phróiseas LLPS trí chosc ar fhoirmiú braoiníní ag baint úsáide as malairt C-críochfort teasctha αS easpa iarmhair 104-140 (Fig. 1a) den (ΔCt- αS) próitéin (Fíor 2f agus Fíor Forlíontach 2d).Deimhníodh comhlonnú αS agus ΔN-Tau le micreascópacht fhluaraiseachta comhfhócasach (Fíor Forlíontach 1b).
Chun an mheicníocht LLPS idir Tau441 agus αS a thástáil tuilleadh, úsáideadh malairt Tau breise, is é sin an croífhiliméad helical péireáilte (PHF) san fhearann ​​ceangailteach microtubule (MTBD), agus má tá ceithre fhearann ​​​​athdhéanta tréithiúla ann, ar a dtugtar go coitianta freisin. mar an blúire K18 (féach Fíor 2e).Tuairiscíodh le déanaí go gceanglaíonn αS go fabhrach le próitéin tau atá suite i bhfearann ​​​​saibhir i bpróilín i seicheamh a thagann roimh an bhfearann ​​​​atá ceangailteach ar mhicritiúbúl.Mar sin féin, tá an réigiún PHF saibhir i iarmhar luchtaithe deimhneach (féach Fíor 2e), go háirithe lísín (15% iarmhair), a spreag dúinn a thástáil an gcuireann an réigiún seo chomh maith le comhdhlúthú an choimpléasc αS/Tau.Thugamar faoi deara nach bhféadfadh K18 amháin LLPS a spreagadh ag tiúchan suas le 100 μM faoi na coinníollacha a tástáladh (maolán LLPS le 15% PEG nó 20% dextran) (Fíor 2f).Mar sin féin, nuair a chuireamar 50 µM αS le 50 µM K18, bhí foirmiú tapa braoiníní próitéine ina bhfuil K18 agus αS ag nephelometry (Fíor Forlíontach. 2d) agus micreascópacht WF (Fíor 2f).De réir mar a bhíothas ag súil leis, ní raibh ΔCt-αS in ann iompar LLPS K18 (Fíor 2f) a athbhunú.Tugaimid faoi deara go n-éilíonn comhiomlánú αS/K18 tiúchain próitéine beagán níos airde chun LLPS a aslú i gcomparáid le αS/ΔNt-Tau nó αS/Tau441, rudaí eile a bheith comhionann.Tá sé seo comhsheasmhach le hidirghníomhú níos láidre idir an réigiún αS C-críochfort leis an bhfearann ​​​​próline-saibhir Tau i gcomparáid leis an bhfearann ​​ceangailteach microtubule, mar a thuairiscítear roimhe seo 31 .
Ós rud é nach féidir le ΔNt-Tau LLPS a dhéanamh in éagmais αS, roghnaigh muid an leagan Tau seo mar mhúnla chun αS/Tau LLPS a thréithriú i bhfianaise a simplíochta i gcórais LLPS le Tau lán-fhad (isitíopa, Tau441/Tau441).le próisis chomhiomlánaithe casta (heititíopacha, αS/Tau441).Rinneamar comparáid idir an méid comhiomlánaithe αS (mar chuid den phróitéin chéim chomhdhlúite, fαS,c) sna córais αS/Tau agus αS/ΔNt-Tau trí lártheifneoiriú agus anailís chéim scaipthe SDS-PAGE (féach 2e), d’aimsigh luachanna an-chosúil do gach próitéin ag an tiúchan céanna.Go háirithe, fuair muid fαS, c 84 ± 2% agus 79 ± 7% le haghaidh αS/Tau agus αS/ΔNt-Tau, faoi seach, rud a thugann le tuiscint go bhfuil an t-idirghníomhú heitreatypic idir αS agus tau níos fearr ná an idirghníomhaíocht idir móilíní tau.idir.
Rinneadh staidéar ar an idirghníomhú le polycations éagsúla agus éifeacht an phróisis comhdhlúthúcháin ar an cinéitic αS den chéad uair ag an aisghabháil fluaraiseachta tar éis photobleaching (FRAP).Rinneamar tástáil ar αS / Tau441, αS / ΔNt-Tau agus αS / pLK coacervates (100 μM αS forlíonta le 2 μM αS AF488-αS agus 100 μM Tau441 nó ΔNt-M pL nó ΔNt-TauK).Fuarthas sonraí laistigh den chéad 30 nóiméad tar éis na comhpháirteanna samplacha a mheascadh.Ó íomhánna ionadaíocha FRAP (Fíor 3a, comhdhlúthú αS/Tau441) agus a gcuair chúrsa ama comhfhreagracha (Fíor 3b, Fíor Fhorlíontach. 3), is féidir a fheiceáil go bhfuil cinéitic αS an-chosúil le cinéitic αS le cinn coacervates Tau441.agus ΔNt-Tau, atá i bhfad níos tapúla le pLK.Is iad na comhéifeachtaí idirleata ríofa do αS laistigh den chomhacervate de réir FRAP (mar a thuairiscítear ag Kang et al. 35) ná D = 0.013 ± 0.009 µm2/s agus D = 0.026 ± 0.008 µm2/s do α α 4/S agus 4 α an córas αS/.pLK, Tau, agus D = 0.18 ± 0.04 µm2/s, faoi seach (Fíor 3c).Mar sin féin, tá an comhéifeacht idirleathadh αS sa chéim scaipthe roinnt orduithe méid níos airde ná gach céim comhdhlúite, mar a chinntear ag Speictreascópacht Comhghaolú Fluaraiseacht (FCS, féach Fíor Forlíontach. 3) faoi na coinníollacha céanna (maolán LLPS) ach in éagmais polycations. ( D = 8 ± 4 µm2/s).Dá bhrí sin, laghdaítear cinéitic aistriúcháin αS go suntasach i coacervates i gcomparáid le próitéiní sa chéim scaipthe mar gheall ar éifeachtaí plódaithe móilíneacha fhuaimnithe, cé go gcoimeádann gach coacervates airíonna cosúil le leacht sa chéad leath uair an chloig tar éis a fhoirmiú, i gcodarsnacht leis an gcéim tau.cinéitic níos tapúla i gcomhdhlúthán pLK.
a–c Anailís FRAP ar dhinimic αS (2% lipéadaithe AF488 αS) i gcomhacervates leictreastatacha.Taispeántar íomhánna ionadaíocha de thástálacha FRAP αS/Tau441 i dtrí chóip in (a), áit a léiríonn ciorcail dearga limistéir dídhaite.Is é 5 µm barra an scála.b Meán-chuair FRAP agus (c) comhéifeachtaí idirleata ríofa (D) do 5–6 (N) braoiníní difriúla ó thrí thurgnamh a úsáideann 100 µM αS agus comhchruinnithe cothromaíochta de Tau441 (dearg) nó ΔNt-Tau (gorm) nó pLK (glas) ag deich n-oiread an chomhchruinnithe de LLPS.Taispeántar diall caighdeánach an chuar FRAP i dath scáthaithe.Chun comparáid a dhéanamh, socraíodh an comhéifeacht idirleata αS sa chéim scaipthe i dtríú háit ag baint úsáide as speictreascópacht chomhghaolmhaireachta fluaraiseachta (FCS) (féach Figiúr Forlíontach 3 agus modhanna le haghaidh tuilleadh faisnéise).d Spectra EPR X-bhanna leanúnach de 100 μM TEMPOL-122-αS i maolán LLPS gan aon polycation (dubh) nó i láthair 100 μM Tau441 (dearg) nó ΔNt-Tau (gorm) nó 1 mM pLK (glas).Taispeánann an inset radharc méadaithe ar na línte páirce láidre ina dtarlaíonn na hathruithe is drámatúla.e Cuair cheangailteach de 50 μM TEMPOL-122-αS le ilghnéitheacha éagsúla in éagmais LLPS (gan PEG).Léirítear go n-ardóidh aimplitiúid laghdaithe banna III i gcomparáid le banna II (IIII/III) den speictream normalaithe EPR na cóimheasa molar de Tau441 (dearg), ΔNt-Tau (gorm) agus pLK (glas).Léiríonn línte daite feiliúnach do shonraí ag baint úsáide as samhail cheangailteach gharbh le n suíomh ceangailteach comhionann agus neamhspleách ar gach cuar.Cuirtear sonraí amh ar fáil i bhfoirm comhaid sonraí amh.
Mar chomhlánú, rinneamar imscrúdú ar dhinimic αS i gcoacervates éagsúla ag baint úsáide as lipéadú casadh treoraithe (SDSL) agus athshondas leanúnach paramagnetic leictreon (CW-EPR).Tá an modh seo an-úsáideach chun solúbthacht agus dinimic an IDP a thuairisciú le réiteach iarmharach réalaíoch36,37,38.Chuige sin, thógamar iarmhair cistéin i mutants Cys aonair agus d'úsáideamar an taiscéalaí casadh 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL).Cuireann díorthaigh Maleimide lipéad orthu.Go sonrach, chuireamar isteach tóireadóirí TEMPOL ag seasamh 122 nó 24 αS (TEMPOL-122-αS agus TEMPOL-24-αS).Sa chéad chás, dírímid ar an réigiún C-críochfort den phróitéin, a bhfuil baint aige le hidirghníomhaíocht le polycations.Ina áit sin, is féidir le seasamh 24 faisnéis a thabhairt dúinn faoi dhinimic fhoriomlán na bpróitéiní sa chomhdhlúthán.Sa dá chás, bhí na comharthaí EPR a fuarthas do phróitéiní na céime scaipthe ag freagairt do radacacha nítrocsaíde sa staid ghasta.Tar éis scaradh céime i láthair tau nó pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 nó ΔNt-Tau ag cóimheas 1: 1 nó pLK ag cóimheas 1:10), tugadh faoi deara méadú ar an buaic-déine coibhneasta i an speictream EPR de αS.Leathnaigh an líne caillteanais, rud a léiríonn cinéitic athdhírithe αS laghdaithe i braoiníní i gcomparáid le próitéin sa chéim caol (Fíor 3d, Fíor Forlíontach 4a).Tá na hathruithe seo níos suntasaí ag suíomh 122. Cé gur ag suíomh 24 níor chuir láithreacht pLK isteach ar chinéitic an taiscéalaí, ag suíomh 122 tháinig athrú suntasach ar chruth na líne speictreach (Fíor Forlíontach 4a).Nuair a rinneamar iarracht an speictream a shamhaltú ag suíomh 122 de dhá chóras αS/il-pholachaithe ag baint úsáide as an tsamhail isotrópach (Fíor Forlíontach 5a) a úsáidtear go coitianta chun cur síos a dhéanamh ar dhinimic an chas-lipéadaithe IDP38,39, ní rabhamar in ann an speictrim turgnamhach a athchruthú..Insamhladh speictreach ar shuíomh 24 spins codarsnachta (Fíor Forlíontach 5a).Tugann sé seo le tuiscint go bhfuil suíomhanna fabhracha i spás na bhfoirmíochtaí casadh de réigiún C-críochfort αS i láthair polycations.Agus an codán de αS sa chéim chomhdhlúite á bhreithniú faoi choinníollacha turgnamhacha EPR (84 ± 2%, 79 ± 7%, agus 47 ± 4% le haghaidh αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, agus αS/pLK, faoi seach - féach an Forlíontach). Fíor 2e den anailís sonraí c), is féidir a fheiceáil go léiríonn an leathnú a bhraitear leis an modh EPR go príomha idirghníomhaíocht an réigiúin C-críochfort de αS le polycations éagsúla sa chéim chomhdhlúite (an príomh-athrú nuair a úsáidtear TEMPOL-122-). αS), agus ní comhdhlúthú próitéine.Breathnaítear méadú ar microviscosity sa probe.De réir mar a bhíothas ag súil leis, rinneadh speictream EPR na próitéine faoi choinníollacha seachas LLPS a athchóiriú go hiomlán nuair a cuireadh 1 M NaCl leis an meascán (Fíor Forlíontach 4b).Tríd is tríd, tugann ár gcuid sonraí le fios go léiríonn na hathruithe a bhraith CW-EPR go príomha idirghníomhaíocht an réigiúin C-críochfort de αS le polycations éagsúla sa chéim chomhdhlúite, agus is cosúil go bhfuil an idirghníomhaíocht seo níos láidre le pLK ná le Tau.
D'fhonn tuilleadh eolais struchtúrach a fháil faoi na próitéiní sa coacervate, shocraigh muid staidéar a dhéanamh ar an gcóras LLPS ag baint úsáide as NMR i dtuaslagán.Mar sin féin, níorbh fhéidir linn ach an codán αS atá fágtha sa chéim scaipthe a bhrath, rud a d'fhéadfadh a bheith mar gheall ar dhinimic laghdaithe próitéine taobh istigh den choacervate agus céim dlúth ag bun an réitigh in anailís NMR.Nuair a rinneamar anailís ar struchtúr agus ar dhinimic an phróitéin atá fágtha sa chéim scaipthe den sampla LLPS ag baint úsáide as NMR (Fíor Forlíontach 5c, d), thugamar faoi deara gur iompraíocht an próitéin beagnach mar an gcéanna i láthair pLK agus ΔNt-Tau, an dá cheann de. a bhí i struchtúr tánaisteach agus i ndinimic cnámh droma na próitéine, arna nochtadh ag turgnaimh ar aistriú ceimiceach tánaisteach agus scíthe R1ρ.Léiríonn sonraí NMR go bhfulaingíonn C-críochfort αS caillteanas suntasach ar sholúbthacht comhfhoirmiúil agus a nádúr neamhord á choinneáil, cosúil leis an gcuid eile den seicheamh próitéine, mar gheall ar a idirghníomhaíochtaí le polacations.
Ós rud é go léiríonn leathnú an chomhartha CW-EPR a breathnaíodh sa chéim chomhdhlúite TEMPOL-122-αS idirghníomhú na próitéine le polacations, rinneamar toirtmheascadh EPR chun cleamhnas ceangailteach αS le polacaí éagsúla a mheas in éagmais LLPS (gan aon carnadh de). LLPS Maoláin), rud a thugann le tuiscint go bhfuil na hidirghníomhaíochtaí mar an gcéanna i gcéimeanna caola agus tiubhaithe (atá deimhnithe ag ár sonraí, Fíor Forlíontach 4a agus Fíor Forlíontach 6).Ba é an sprioc a bhí ann féachaint an dtaispeánann gach coacervates, in ainneoin a n-airíonna coitianta cosúil le sreabhán, aon iompar difreálach bunúsach ag an leibhéal móilíneach.De réir mar a bhíothas ag súil leis, leathnaigh an speictream EPR le méadú ar thiúchan polycation, rud a léiríonn laghdú ar sholúbthacht mhóilíneach mar gheall ar idirghníomhaíochtaí móilíneacha na gcomhpháirtithe idirghníomhaíochta go léir beagnach go dtí an sáithiúchán (Fíor 3e, Fíor Fhorlíontach. 6).Bhain pLK an sáithiú seo amach ag cóimheas molar níos ísle (polacation:αS) i gcomparáid le ΔNt-Tau agus Tau441.Déanta na fírinne, léirigh comparáid idir na sonraí le múnla ceangailteach gar ag glacadh leis n suíomh ceangailteach comhionann agus neamhspleách go bhfuil an tairiseach díthiomsaithe dealraitheach de pLK (~5 μM) ord méide níos ísle ná an ceann de Tau441 nó ΔNt-Tau (~50 μM ).µM).Cé gur meastachán garbh é seo, tugann sé seo le fios go bhfuil cleamhnas níos airde ag αS maidir le polaireachtaí níos simplí le réigiúin lucht leanúna dearfacha.I bhfianaise na difríochta seo i gcleamhnas idir αS agus polycations éagsúla, rinneamar hipitéis go bhféadfadh a n-airíonna leachtacha athrú go héagsúil le himeacht ama agus dá bhrí sin fulaingt ó phróisis LSPT éagsúla.
I bhfianaise na timpeallachta an-phlódaithe laistigh den chuascharbáit phróitéin agus nádúr amyloid na próitéine, thugamar faoi deara iompar an chógasváit le himeacht ama chun próisis féideartha LSPT a bhrath.Ag baint úsáide as micreascópacht BF agus CF (Fíor 4), thugamar faoi deara go bhfuil αS/Tau441 ag coacervates go mór i dtuaslagán, ag cruthú braoiníní móra a théann i dteagmháil le agus a fhliuchann an dromchla ag bun an tobair/sleamhnáin mar bhraoiníní iomlána, mar a bheifí ag súil leis (Fíor Forlíontach. .7d);tugaimid “raftaí próitéine” ar na struchtúir bhunfhoirmithe seo.D'fhan na struchtúir seo sreabhán mar gur choinnigh siad an cumas comhleá (Fíor Fhorlíontach 7b) agus d'fhéadfaí iad a fheiceáil ar feadh roinnt uaireanta tar éis do LLPS a bheith spreagtha (Fíor 4 agus Fíor Forlíontach 7c).Thugamar faoi deara go bhfuil an próiseas fliuchtaithe bail ar fónamh orthu ar dhromchla na n-ábhar hydrophilic seachas hidreafóbach (Fíor Forlíontach 7a), mar a bhíothas ag súil le haghaidh coacervates leictreastatach le muirir neamhchothrom agus dá bhrí sin féidearthachtaí dromchla ard leictreastatach.Go háirithe, αS / ΔNt-Tau comhdhlúthú agus rafting Bhí laghdú suntasach, agus αS / comhdhlútháin pLK Bhí laghdú suntasach (Fíor 4).Le linn an ama gor gearr, bhí na braoiníní αS/pLK in ann an dromchla hidrofilic a chónascadh agus a fhliuchadh, ach stop an próiseas seo go tapa agus tar éis 5 uair an chloig goir, níor breathnaíodh ach teagmhais chomhdhlúthúcháin teoranta agus níor breathnaíodh aon fhliuchadh.– trasdul glóthach-drip.
Ionadaí BF (painéil liathscála) agus CF (painéil ar dheis, AF488-lipéadaithe αS i glas) de shamplaí coacervate ina bhfuil 100 µM αS (1% lipéad fluaraiseacha) i LLPS maolán i láthair 100 µM Tau441 (barr) fluaraiseacht) íomhánna micreascópacha ΔN -Tau (lár) nó 1 mM pLK (bun) ag amanna goir éagsúla agus airde fócasach (z, fad ó bhun an pláta go maith).Rinneadh na turgnaimh arís agus arís eile 4-6 huaire go neamhspleách ar a chéile leis na torthaí céanna.Déantar coacervates αS/Tau441 a fhliuchadh tar éis 24 uair an chloig, ag cruthú raftaí níos mó ná an íomhá.Is é 20 µm barra scála na n-íomhánna go léir.
D'fhiafraigh muid ansin an mbeadh comhiomlánú amyloid d'aon cheann de na próitéiní a ndearnadh staidéar orthu mar thoradh ar na linnte móra próitéine cosúil le sreabhán a foirmíodh in αS/Tau441 LLPS.Leanamar ar aibiú braoiníní αS/Tau441 le himeacht ama le micreascópacht WF faoi na coinníollacha céanna thuas, ach ag baint úsáide as 1 μM AF488-lipéadaithe αS agus Atto647N-lipéadaithe Tau441 (Fíor 5a).Mar a bheifí ag súil leis, thugamar faoi deara logánú iomlán próitéine le linn an phróisis aibithe.Suimiúil go leor, ó ca.Tar éis 5 uair an chloig, breathnaíodh struchtúir neamhchiorclach níos déine taobh istigh de na raftaí, ar a dtugamar “pointí”, cuid acu a comhlocalized le αS, agus saibhríodh cuid acu i Tau441 (Fíor 5a, saigheada bán).Breathnaíodh na spotaí seo i gcónaí laistigh de raftaí níos mó do αS/ΔNt-Tau ná do αS/ΔNt-Tau.Ní raibh aon spotaí ar leith sna braoiníní de chórais pLK agus Tau nach bhfuil inniúil chun comhleá/fliuchadh.Chun a thástáil an bhfuil na stains seo ina bhfuil αS agus Tau441 cosúil le comhiomláin amyloid, rinneamar turgnamh den chineál céanna ag baint úsáide as micreascópacht CF inar lipéadaíodh Tau441 le Atto647N agus cuireadh 12.5 μM thioflavin-T (ThT) sainiúil amyloid leis ón tús.lí.Cé nár breathnaíodh braoiníní nó raftaí αS/Tau441 T-staining fiú tar éis 24 h goir (Fíor 5b, braoiníní barr a bhí fágtha thar raftaí próitéine), bhí struchtúir ThT-dearfach ina raibh Atto647N-Tau441 taobh istigh de na raftaí an-lag.macasamhail sé seo méid, cruth, agus suíomh na spotaí a ndearnadh cur síos orthu roimhe seo (Fíor 5b, sraitheanna lár agus bun), rud a thugann le tuiscint go bhféadfadh na spotaí freagairt do chomhiomláin amyloid-mhaith a foirmíodh i coacervates sreabhán ag dul in aois.
WF 25 μM αS ag amanna goir éagsúla agus airde fócasach (z, fad ón mbun neamhcheangailte) i láthair 25 μM Tau441 (1 μM AF488-lipéadaithe αS agus Atto647N-lipéadaithe Tau441) i tobar pláta micreascóp le maolán LLPS) .Rinneadh sé thurgnamh go neamhspleách arís le torthaí comhchosúla.b íomhá micreascópach CF de 25 μM αS i láthair 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N lipéadaithe Tau441) agus 12.5 μM thioflavin-T (ThT).Taispeántar braoiníní próitéine ualaithe agus raftaí agus spotaí próitéine taiscthe sna sraitheanna barr agus lár, faoi seach.Taispeánann an tsraith íochtair íomhánna de raftaí agus braon ó 3 mhacasamhlú neamhspleácha.Léiríonn saigheada bána poncanna ThT-dearfach sa dá phainéal.Is é 20 µm barra scála na n-íomhánna go léir.
Chun scrúdú níos mine a dhéanamh ar na hathruithe sa líonra próitéin coacervate le linn an aistrithe ó leacht go soladach, d'úsáideamar íomháú fluaraiseachta ar feadh an tsaoil (FLIM) agus micreascópacht aistrithe fuinnimh athshondais Förster (FRET) (Fíor 6 agus Fíoracha Forlíontacha 8 agus 9).Rinneamar hipitéisiú go n-eascraíonn aibiú coacervate an chiseal isteach i struchtúr próitéine comhiomlán níos comhdhlúite nó fiú soladach-mhaith teagmháil níos dlúithe idir an próitéin agus an taiscéalaí fluaraiseacha a ghabhann leis, rud a d'fhéadfadh éifeacht múchadh a tháirgeadh a léirítear i saolré an tstórais giorraithe (τ) , mar a thuairiscítear roimhe seo40.,41 ,42.Ina theannta sin, i gcás samplaí lipéadaithe dúbailte (AF488 agus Atto647N mar ruaimeanna deontóra agus glacóra FRET, faoi seach), is féidir comhdhlúthú coacervate agus méadú ar éifeachtúlacht FRET(E) le linn LSPT a bheith ag gabháil leis an laghdú τ seo freisin.Rinneamar monatóireacht ar fhoirmiú rafta agus spot le himeacht ama i samplaí LLPS αS/Tau441 agus αS/ΔNt-Tau (25 µM de gach próitéin i maolán LLPS ina raibh 1 µM AF488 lipéadaithe αS agus/nó Atto647N lipéadaithe Tau441 nó ΔNt-Tau).Thugamar faoi deara treocht ghinearálta sa mhéid is gur tháinig laghdú beag ar shaolré fhluaraiseachta na tóireadóirí AF488 (τ488) agus Atto647N (τ647N) de réir mar a tháinig na coacervates in aibíocht (Fíor 6 agus Fíor Forlíontach 8c).Suimiúil go leor, cuireadh feabhas suntasach ar an athrú seo le haghaidh poncanna laistigh de raftaí (Fíor 6c), rud a léiríonn gur tharla comhdhlúthú próitéine breise ag poncanna.Mar thaca leis seo, níor tugadh faoi deara aon athrú suntasach ar shaolré an fhluaraiseachta do bhraoiníní αS/ΔNt-Tau d’aois ar feadh 24 h (Fíor Fhorlíontach 8d), rud a thugann le tuiscint gur próiseas éagsúil ó spotting é geiliú braoiníní agus nach bhfuil atheagrú móilíneach suntasach ag gabháil leis. laistigh de coacervates.Ba chóir a thabhairt faoi deara go bhfuil méideanna éagsúla agus ábhar athraitheach ag na poncanna i αS, go háirithe don chóras αS/Tau441 (Fíor Forlíontach 8e).In éineacht leis an laghdú ar shaolré an fhluaraiseachta spota bhí méadú ar dhéine, go háirithe i gcás Atto647N lipéadaithe Tau441 (Fíor Forlíontach 8a), agus éifeachtúlachtaí FRET níos airde do chórais αS/Tau441 agus αS/ΔNt-Tau araon, rud a léiríonn comhdhlúthú breise i gCúig huaire an chloig LLPS. tar éis spreagtha, na próitéiní taobh istigh den leictreachas statach comhdhlúite.I gcomparáid le αS/ΔNt-Tau, thugamar faoi deara τ647N níos ísle agus luachanna τ488 beagán níos airde i spotaí αS/Tau441, in éineacht le luachanna FRET níos ísle agus níos neamhaonchineálach.B’fhéidir go bhfuil baint aige seo leis an bhfíric go bhfuil an raidhse αS breathnaithe agus ionchais i gcomhiomláin níos ilchineálaí, go minic substichiometric i gcomparáid le Tau, sa chóras αS/Tau441, ós rud é go bhféadfadh Tau441 féin dul faoi LLPS agus comhiomlánú freisin (Fíor Forlíontach 8e). .Mar sin féin, is é an leibhéal comhaontaithe braoiníní, foirmiú rafta, agus, níos tábhachtaí fós, comhiomlánú próitéine laistigh de chomhghleacaithe cosúil le leacht uasta nuair a bhíonn Tau441 agus αS araon i láthair.
a Íomhánna micreascópachta fluaraiseachta ar feadh an tsaoil (FLIM) de αS/Tau441 agus αS/ΔNt-Tau ag 25 μM de gach próitéin (1 μM AF488-lipéadaithe αS agus 1 μM Atto647N-lipéadaithe Tau441 nó ΔNT-Tau).Taispeánann na colúin íomhánna ionadaíocha de shamplaí LLPS ag amanna aibithe éagsúla (30 min, 5 h agus 24 h).Taispeánann an fráma dearg an réigiún ina bhfuil spotaí αS/Tau441.Taispeántar raonta saoil mar bharraí datha.Barra scála = 20 µm do gach íomhá.b Íomhá FLIM súmáilte isteach den limistéar roghnaithe, a thaispeántar sa bhosca dearg i bpainéal a.Taispeántar raonta saoil ag baint úsáide as an scála datha céanna agus atá i bpainéal a.Barra scála = 5 µm.c Histeagraim a thaispeánann AF488 (ceangailte le αS) nó Atto647N (ceangailte le Tau) do speicis éagsúla próitéine (braoiníní-D-, raft-R- agus breac-P) a aithníodh in íomhánna FLIM arna dtaifeadadh le haghaidh αS-) dáileacháin uainiúcháin shaolré Tau441 agus Samplaí coacervate αS/ΔNt-Tau (N = 17-32 ROI le haghaidh D, 29-44 ROI le haghaidh R, agus 21-51 ROI le haghaidh pointí).Taispeántar meánluachanna agus meánluachanna mar chearnóga buí agus línte dubha taobh istigh de bhoscaí, faoi seach.Léiríonn teorainneacha íochtair agus uachtair an bhosca an chéad agus an tríú ceathairíl, faoi seach, agus léirítear na luachanna íosta agus uasta laistigh den raon idircheathairíle 1.5-huaire (IQR) mar ghuairneáin.Taispeántar asluitigh mar diamaint dhubh.Rinneadh tábhacht staitistiúil idir péirí dáileacháin a chinneadh trí úsáid a bhaint as t-tástáil dhá shampla, ag glacadh leis go raibh éagsúlachtaí neamhionann.Taispeántar luachanna p-tástála dhá earr le réiltíní do gach péire sonraí comparáide (* p-value > 0.01, ** p-value > 0.001, *** p-value > 0.0001, **** p-value > 0.00001), ns Léiríonn sé faillí (p-luach > 0.05).Tugtar na luachanna cruinne p i dTábla Forlíontach 1, agus cuirtear na sonraí bunaidh i láthair mar chomhaid sonraí amh.
Chun nádúr amyloid-mhaith na bpeacaí/comhiomláin a léiriú tuilleadh, chuireamar cóireáil ar shamplaí coacervate neamhdhaite ar feadh 24 uair an chloig le tiúchain arda de (1 M) NaCl, rud a d’fhág gur scaradh comhiomláin ó choacervates próitéine.Nuair a breathnaíodh comhiomláin scoite (ie, tuaslagán scaipthe comhiomláin) ag baint úsáide as micreascópacht fórsa adamhach (AFM), thugamar faoi deara moirfeolaíocht sféarúil den chuid is mó le airde rialta de thart ar 15 nm, a bhfuil claonadh ann a chomhlachú faoi choinníollacha tiúchan ard salainn, cosúil le iompar fibrilí amyloid tipiciúil mar gheall ar an éifeacht láidir hidreafóbach ar an dromchla (tabhair faoi deara go mbíonn airde de ~10 nm de ghnáth ag fibrilí) (Fíor Forlíontach 10a).Is díol suntais é, nuair a chothaigh comhiomláin scoite le ThT i measúnacht chaighdeánach fhluaraiseachta thT, thugamar faoi deara méadú suntasach ar tháirgeacht chandamach fhluaraiseachta ThT, atá inchomparáide leis an méid a breathnaíodh nuair a bhí an dath gortha le fibrilí amyloid αS tipiciúil (Fíor Forlíontach 10b), rud a thugann le tuiscint tá struchtúir atá cosúil le hamyloid sna comhiomláin coacervate..Go deimhin, bhí na comhiomláin tolerant le tiúchan ard salainn ach íogair do 4 M clóiríd guanidine (GdnHCl), cosúil le fibrilí amyloid tipiciúil (Fíor Forlíontach 10c).
Ansin, rinneamar anailís ar chomhdhéanamh na gcomhiomlán ag baint úsáide as fluaraiseacht móilín aonair, comhghaol sonrach fluaraiseachta / speictreascópacht tras-chomhghaolú (FCS / FCCS), agus anailís pléasctha ar bhrath comhtharlú dhá-dath (TCCD).Chuige sin, rinneamar comhiomláin scoite a foirmíodh tar éis 24 uair an chloig goir i 100 μl sampla LLPS ina raibh αS agus Tau441 (25 μM araon) mar aon le 1 μM AF488-lipéadaithe αS agus 1 μM Atto647N lipéadaithe Tau441.Caolaigh an tuaslagán comhiomlán scaipthe a bhíonn mar thoradh air go dtí staid mhonamhóilínigh ag baint úsáide as an maolán céanna saor ó PEG agus 1 M NaCl (an maolán céanna a úsáidtear chun comhiomláin a scaradh ón gcoacervate) chun aon idirghníomhaíochtaí leictreastatacha idir LLPS agus próitéin a chosc.Tá sampla de rian ama móilín aonair le feiceáil i bhFíor 7a.Léirigh anailís FCCS/FCS (tras-chomhghaolú, CC agus uath-chomhghaolú, AC) go raibh comhiomláin ina raibh αS agus tau flúirseach sna samplaí (féach cuar CC i bhFíor 7b, an painéal ar chlé), agus d’eascair farasbarr de phróitéin mhonaiméirí iarmharach mar a toradh an phróisis chaolaithe (féach cuair AC i bhFíor 7b, painéal ar chlé).Níor léirigh turgnaimh rialaithe a rinneadh faoi na coinníollacha réitigh céanna ag baint úsáide as samplaí nach raibh iontu ach próitéiní monaiméireacha aon chuair CC, agus luíonn na cuair AC go maith leis an tsamhail idirleata aon-chomhpháirt (Eq. 4), áit a bhfuil na comhéifeachtaí idirleata ionchais ag próitéiní monaiméireacha (Fíor 7b. ), painéal ar dheis).Tá comhéifeacht idirleata na gcáithníní comhiomlánaithe níos lú ná 1 µm2/s, agus tá comhéifeacht próitéiní monaiméireacha thart ar 1 µm2/s.50–100 µm/s;tá luachanna cosúil le luachanna a foilsíodh roimhe seo le haghaidh fibrilí amyloid sonicated αS agus monaiméireacha αS ar leithligh faoi choinníollacha réitigh den chineál céanna44.Nuair a rinneamar anailís ar na comhiomláin le hanailís pléascadh TCCD (Fíor 7c, barrphainéal), fuaireamar amach i ngach comhiomlán leithlis (αS/Tau heteroaggregate), go raibh thart ar 60% de na comhiomláin braite αS agus tau araon, nach raibh ach thart ar 30% iontu. tau, thart ar 10% αS amháin.Léirigh anailís stoichiometric ar heitrea-chomhiomláin αS/Tau go raibh an chuid is mó de na heitrea-chomhiomláin saibhrithe i dtau (stoichiometry faoi bhun 0.5, tá meánlíon na móilíní tau in aghaidh an chomhiomlán 4 huaire níos mó ná móilíní αS), atá ag teacht lenár gcuid oibre a breathnaíodh in FLIM in situ turgnaimh..Léirigh anailís FRET go raibh an dá phróitéin sna comhiomláin seo, cé nach bhfuil tábhacht mhór ag baint leis na luachanna iarbhír FRET sa chás seo, ós rud é go raibh dáileadh na fluarafór i ngach comhiomlán randamach mar gheall ar bharrachas próitéin neamhlipéadaithe a úsáideadh sa turgnamh.Suimiúil go leor, nuair a rinne muid an anailís chéanna ag baint úsáide as an 45,46 amyloid aibí comhiomlánú-easnamhach Tau athraitheach (féach Forlíontach Fíor. 11a, b), thugamar faoi deara cé go raibh an comhiomlánú leictreastatach αS mar an gcéanna (Fíor Forlíontach 11c, d), laghdaíodh go mór an cumas comhiomláin a fhoirmiú laistigh den chomhghleacaí agus bhraith FLIM roinnt spotaí i dturgnaimh in situ, agus breathnaíodh cuair laga tras-chomhghaolaithe do shamplaí comhiomlán scoite.Mar sin féin, i gcás líon beag comhiomláin braite (ach an deichiú cuid de Tau441), thugamar faoi deara go raibh gach comhiomlán saibhrithe i αS ná an t-athrú Tau seo, le thart ar 50% de na comhiomláin braite nach raibh ach móilíní αS iontu, agus bhí αS ilchineálach sa bhreis. .comhiomláin (féach Fíor Fhorlíontach 11e), i gcodarsnacht leis na comhiomláin ilchineálacha a ghin Tau441 (Fíor 6f).Léirigh torthaí na dturgnaimh seo, cé go bhfuil αS féin in ann carnadh le tau laistigh den coacervate, tá tau nucleation níos fabhraí faoi na coinníollacha seo, agus go bhfuil na comhiomláin amyloid-mhaith mar thoradh air in ann gníomhú mar fhoirm αS agus tau.Mar sin féin, a luaithe a chruthaítear croí saibhir tau, is fearr idirghníomhaíochtaí heitreatypiceacha idir αS agus tau mar chomhiomláin thar idirghníomhaíochtaí homaitíopacha idir móilíní tau;Breathnaímid freisin ar líonraí próitéine i gcoacervates leachtacha αS/tau.
a Fluaraiseacht Ionadaíoch rianta ama de mhóilíní aonair de chomhiomláin scoite a fhoirmítear i gcomhacervates leictreastatacha αS/Tau441.Breathnaíodh pléascanna a chomhfhreagraíonn do chomhiomláin αS/Tau441 (pléascann os cionn na tairsí sonraithe) i dtrí bhealach braite (AF488 agus Atto647N astú tar éis excitation díreach, línte gorm agus dearg, astú Atto647N tar éis excitation indíreach), FRET, líne violet.b Anailís FCS/FCCS ar shampla de chomhiomláin scoite αS/Tau441 a fuarthas ó LLPS (an painéal ar chlé).Taispeántar cuair uath-chomhghaolaithe (AC) le haghaidh AF488 agus Atto647N i gorm agus dearg, faoi seach, agus taispeántar cuair tras-chomhghaolaithe (CC) a bhaineann le comhiomláin ina bhfuil an dá ruaim i corcra.Léiríonn na cuair AC láithreacht speiceas lipéadaithe monaiméireach agus comhiomlán próitéine, agus ní léiríonn na cuair CC ach idirleathadh comhiomláin lipéadaithe dúbailte.An anailís chéanna, ach faoi na coinníollacha réitigh céanna mar atá i spotaí scoite, taispeántar samplaí nach bhfuil ach αS monaiméireach agus Tau441 mar rialuithe sa phainéal ceart.c Anailís fhluaraiseachta splanc ar mhóilíní singil de chomhiomláin scoite a fhoirmítear i gcomhacairváití leictreastatacha αS/Tau441.Déantar faisnéis maidir le gach comhiomlán a fhaightear i gceithre athrá dhifriúla (N = 152) a bhreacadh i gcoinne a stoichiometry, luachanna S, agus éifeachtúlacht FRET (painéal barr, léiríonn barra datha tarlaithe).Is féidir trí chineál comhiomláin a idirdhealú: -αS-amháin comhiomláin le S~1 agus FRET~0, comhiomláin Tau amháin le S~0 agus FRET~1, agus comhiomláin ilchineálacha Tau/αS le S~idirmheánach agus FRET Meastacháin ar an méid den dá phróitéin marcóra a bhraitear i ngach comhiomlán ilchineálach (N = 100) taispeántar sa phainéal íochtair (léiríonn an scála datha an teagmhas).Cuirtear sonraí amh ar fáil i bhfoirm comhaid sonraí amh.
Tuairiscíodh go bhfuil baint le himeacht ama ag aibiú nó ag dul in aois comhdhlútháin leachtphróitéine isteach i struchtúir sholadach nó glóthacha le himeacht ama i roinnt feidhmeanna fiseolaíocha an chomhdhlútháin47 chomh maith le galair, mar phróiseas neamhghnácha roimh chomhiomlánú amyloid 7, 48, 49. Anseo déanaimid mionstaidéar ar scaradh agus ar iompar céime.LSPT αS i láthair polycations randamach i dtimpeallacht rialaithe ag tiúchain íseal micromolar agus coinníollacha fiseolaíocha ábhartha (tabhair faoi deara gurb é an tiúchan fiseolaíoch ríofa de αS ná >1 µM50), tar éis iompar tipiciúil teirmidinimiciúla LPS.Fuaireamar amach go bhfuil αS, ina bhfuil réigiún C-críochfort atá luchtaithe go mór diúltach ag pH fiseolaíoch, in ann braoiníní saibhir i bpróitéin a fhoirmiú i dtuaslagán uiscí trí LLPS i láthair peiptídí an-neamhord cationic mar pLK nó Tau tríd an bpróiseas leictreastatach. comhdhlúthú casta i láthair mhacramóilíní comhiomlánaithe.D’fhéadfadh éifeachtaí ábhartha a bheith ag an bpróiseas seo sa timpeallacht cheallacha ina dtagann αS ar mhóilíní ilchatagánacha éagsúla a bhaineann lena chomhiomlánú in vitro agus in vivo51,52,53,54 araon.
I go leor staidéar, measadh go bhfuil dinimic próitéine laistigh de bhraoiníní ar cheann de na príomhfhachtóirí a chinneann an próiseas aibithe55,56.I αS leictreastatach coacervates le polycations, is cosúil an próiseas aibithe ag brath ar an neart na n-idirghníomhaíochtaí le polycations, an valence, agus iolrachas na n-idirghníomhaíochtaí.Tugann teoiric na cothromaíochta le fios gurb é a bheadh ​​i dtírdhreach cothromaíochta de dhá stát leachtacha ná braoinín mór saibhir i mbithpholaiméirí a thiomáineann LLPS57,58.Is féidir fás braoin a bhaint amach trí aibiú Ostwald59, comhalescence60 nó tomhaltas monaiméir saor in aisce sa chéim scaipthe61.I gcás αS agus Tau441, ΔNt-Tau nó pLK, díríodh an chuid is mó den phróitéin sa chomhdhlúthán faoi na coinníollacha a úsáideadh sa staidéar seo.Mar sin féin, cé gur tháinig braoiníní tau lánmhéide le chéile go tapa ar fhliuchadh dromchla, bhí cónascadh braoiníní agus fliuchadh deacair do ΔNt-Tau agus pLK, rud a thugann le tuiscint go raibh caillteanas tapa airíonna leachtacha sa dá chóras seo.De réir ár n-anailís FLIM-FRET, léirigh na braoiníní sean-pLK agus ΔNt-Tau comhiomlánú próitéine (saoil fhluaraiseachta comhchosúil) leis na braoiníní bunaidh, rud a thugann le tuiscint gur coinníodh an gréasán próitéine bunaidh, cé go raibh sé níos docht.
Déanaimid ár dtorthaí turgnamhacha a réasúnú sa mhúnla seo a leanas (Fíor 8).Is minic gur líonraí próitéine iad na braoiníní a fhoirmítear ar dtús go sealadach gan cúiteamh leictreastatach, agus dá bhrí sin tá réimsí éagothroime muirir ann, go háirithe ag an gcomhéadan droplet, agus mar thoradh air sin bíonn braoiníní le cumas dromchla leictreastatach ard.Mar chúiteamh ar mhuirear (feiniméan dá ngairtear ídiú valence de ghnáth) agus acmhainneacht dromchla na mbraoiníní a íoslaghdú, is féidir leis na braoiníní polaipeiptítí nua ón gcéim chaolaithe a áireamh, líonraí próitéine a atheagrú chun idirghníomhaíochtaí luchta a bharrfheabhsú, agus idirghníomhú le braoiníní eile.le dromchlaí (wetting).Is cosúil go bhfuil na braoiníní αS/pLK, mar gheall ar a líonra próitéine níos simplí (ach idirghníomhaíochtaí heitreaitíopacha idir αS agus pLK) agus cleamhnas níos mó le haghaidh idirghníomhaíochtaí próitéine-próitéine, in ann muirear an chomhdhlútháin a chothromú níos tapúla;go deimhin, thugamar faoi deara cinéitic próitéine níos tapúla i coacervates αS / pLK foirmíodh ar dtús ná i αS / Tau.Tar éis ídiú valence, éiríonn na hidirghníomhaíochtaí níos lú gearrshaolach agus cailleann na braoiníní a n-airíonna leachtacha agus casann siad braoiníní neamh-inadhainte cosúil le glóthach a bhfuil poitéinseal dromchla íseal leictreastatach acu (agus mar sin níl siad in ann an dromchla a fhliuchadh).I gcodarsnacht leis sin, níl braoiníní αS/Tau chomh héifeachtúil maidir le huasmhéadú a dhéanamh ar chothromaíocht na muirear braoiníní mar gheall ar líonraí próitéine níos casta (le hidirghníomhaíochtaí homotypic agus heitritíopacha araon) agus nádúr níos laige na n-idirghníomhaíochtaí próitéine.Is é an toradh a bhíonn air seo ná braoiníní a choinníonn iompar leachtach ar feadh tréimhsí fada ama agus a thaispeánann ardacmhainneacht dromchla leictreastatach a íoslaghdaítear trí chomhthiomsú agus fás (ar an gcaoi sin íoslaghdaítear an cóimheas idir achar dromchla/toirte na braoiníní) agus an ceimic dromchla hidreafail a fhliuchadh.Cruthaíonn sé seo leabharlanna móra próitéine tiubhaithe a choinníonn airíonna sreabhán mar go bhfanann na hidirghníomhaíochtaí an-neamhbhuan mar gheall ar an gcuardach leanúnach ar bharrfheabhsú muirear sa líonra próitéine.Is díol spéise é go léiríonn foirmeacha teasctha N-teoranta Tau, lena n-áirítear roinnt isoforms a tharlaíonn go nádúrtha62, iompar idirmheánach, agus roinnt coacervates ag dul in aois le αS ina braoiníní fadsaoil cosúil le glóthach, agus athraíonn cinn eile go comhdhlútháin leachta móra.Tá an déúlacht seo maidir le haibiú coacervates leictreastatacha αS comhsheasmhach le staidéir theoiriciúil agus thurgnamhach LLPS le déanaí a d’aithin comhghaol idir ídiú valence agus criathar leictreastatach i gcomhdhlútháin mar eochair chun méid comhdhlútháin agus airíonna sreabhán a rialú.Meicníocht 58.61.
Léiríonn an scéim seo an cosán comhiomlánaithe amyloid toimhde do αS agus Tau441 trí LLPS agus LSPT.Le réigiúin bhreise atá saibhir i anian (dearg) agus saibhir i gcaití (gorm), tá fuinneamh dromchla níos ísle ag coacervates leictreastatacha αS agus tau le valence sásúil agus dá bhrí sin níos lú comhtháthaithe, rud a fhágann go bhfuil dul in aois braoiníní tapa.Baintear amach staid glóthach neamh-cheirtleánaithe cobhsaí..Tá an cás seo an-fhabhrach i gcás an chórais αS/pLK mar gheall ar a ghréasán idirghníomhaíochta péire próitéine-cleamhnais níos airde agus níos simplí, a cheadaíonn aistriú tapa cosúil le glóthach.A mhalairt ar fad, braoiníní le valence míshásúil agus, dá bhrí sin, réigiúin luchtaithe próitéine ar fáil le haghaidh idirghníomhú, é a dhéanamh níos éasca don coacervate a comhleá agus fliuchadh an dromchla hydrophilic chun laghdú ar a fhuinneamh dromchla ard.Is fearr an cás seo i gcás coacervates αS/Tau441, a bhfuil líonra casta ilfhiúsach acu comhdhéanta d'idirghníomhaíochtaí lag Tau-Tau agus αS-Tau.Ina dhiaidh sin, coimeádfaidh coacervates níos mó a n-airíonna cosúil le sreabhán níos éasca, rud a fhágann gur féidir idirghníomhaíochtaí próitéine-go-próitéin eile tarlú.Faoi dheireadh, comhiomláin ilchineálach amyloid ina bhfuil an dá fhoirm αS agus tau laistigh den sreabhach coacervate, a d'fhéadfadh a bheith bainteach leo siúd a fhaightear i gcomhlachtaí cuimsithe, ar sainmharcanna galair neurodegenerative iad.
Is taiscumair iontacha iad na struchtúir mhóra cosúil le sreabhán a foirmíodh le linn aibithe αS/Tau441 le timpeallacht phróitéin an-phlódaithe ach dinimiciúil agus, go pointe níos lú, coacervates αS/ΔNt-Tau le haghaidh comhiomlánú próitéine a chothú.Thugamar faoi deara go deimhin foirmiú comhiomláin próitéine soladacha sa chineál seo coacervates próitéin, go minic ina bhfuil αS agus tau araon.Tá sé léirithe againn go bhfuil na heitrea-chomhiomláin seo cobhsaithe ag idirghníomhaíochtaí neamhleictreastatacha, go bhfuil siad in ann ruaimeanna ThT a bhaineann go sonrach le amyloid a cheangal ar an mbealach céanna le fibrilí amyloid tipiciúla, agus go deimhin tá friotaíocht comhchosúil acu le tionchair éagsúla.Taispeánadh go raibh airíonna amyloid-chosúil ag na comhiomláin αS/tau arna bhfoirmiú ag LLPS.Go deimhin, tá an malairt aibí Tau easnamhach i gcomhiomlánú amyloid lagaithe go mór i bhfoirmiú na gcomhiomlán αS ilchineálach seo laistigh den coacervate leictreastatach leachtach.Níor breathnaíodh foirmiú comhiomláin αS/Tau441 ach taobh istigh de na coacervates, rud a choinnigh airíonna cosúil le leacht, agus riamh, murar shroich na coacervates / braoiníní an staid glóthach.Sa chás deireanach, cuireann neart méadaithe na n-idirghníomhaíochtaí leictreastatacha agus, mar thoradh air sin, docht an líonra próitéin cosc ​​ar na hathshocruithe riachtanacha comhfhoirmiúla próitéiní chun idirghníomhaíochtaí próitéine nua a bhunú atá riachtanach le haghaidh núiclithe amyloid.Mar sin féin, is féidir é seo a bhaint amach le coacervates níos solúbtha, cosúil le leacht, atá níos dóichí go bhfanfaidh leachtach mar a mhéadaíonn siad i méid.
Toisc gur fearr comhiomláin a fhoirmiú laistigh den chéim chomhdhlúite i gcomhdhlútháin mhóra αS/Tau ná i mbraoiníní beaga a fhoirmíonn go tapa, leagann sé béim ar a ábhartha atá sé na fachtóirí a rialaíonn comhdhlúthú braoiníní a shainaithint.Mar sin, ní hamháin go bhfuil claonadh ann le haghaidh deighilte céimnithe, ach ní mór méid an chomhdhlútháin a rialú chun go bhfeidhmeoidh sé i gceart chomh maith le galair a chosc58,61.Léiríonn ár dtorthaí freisin an tábhacht a bhaineann leis an gcothromaíocht idir LLPS agus LSPT don chóras αS/Tau.Cé go bhféadfadh foirmiú braoiníní cosaint a thabhairt i gcoinne comhiomlánú amyloid trí laghdú a dhéanamh ar an méid monaiméirí próitéine atá ar fáil faoi choinníollacha sáithiúcháin, mar atá molta i gcórais eile63,64, d’fhéadfadh comhiomlánú próitéin inmheánach a bheith mar thoradh ar chomhleá braoiníní ag leibhéil arda braoiníní trí athshocruithe malla comhfhoirmithe.líonraí próitéine..
Tríd is tríd, cuireann ár gcuid sonraí béim láidir ar ábharthacht valence comhtháite agus idirghníomhaíochtaí sásta/míshásta i líonraí titim i gcomhthéacs LSPT.Léirímid go háirithe go bhfuil comhdhlútháin lánfhad αS/Tau441 in ann comhdhlútháin agus núicléasú a dhéanamh go héifeachtach chun heitrea-chomhiomláin amyloid-mhaith a fhoirmiú a chuimsíonn an dá phróitéin agus a mholann meicníocht mhóilíneach bunaithe ar ár dtorthaí turgnamhacha.D’fhéadfadh go mbeadh baint ag comh-chomhiomlánú dhá phróitéin sa chomhiomlánú sreabhán αS/Tau a thuairiscímid anseo le comhlonnú dhá phróitéin i gcuimsithe, ar sainmharcanna an ghalair iad, agus d’fhéadfadh go gcuideodh sé le tuiscint a fháil ar an ngaol idir LLPS agus comhiomlánú amyloid, ag réiteach an bhealaigh le haghaidh IDP ard-mhuirearaithe i néar-mhíghiniúint.
Cuireadh monaiméireacha WT-αS, sócháin cistéin (Q24C-αS, N122C-αS) agus ΔCt-αS variant (Δ101-140) in iúl in E. coli agus íonaithe mar a thuairiscítear roimhe seo.Áiríodh 5 mM DTT i ngach céim maidir le íonú sócháin αS cysteine ​​​​chun foirmiú bannaí disulfide a chosc.Tau441 isoform (plasmid a fhaightear ó Addgene #16316), malairt ΔNt-Tau (Δ1–150, a fhaightear trí IVA a chlónáil le primers CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTCTTTAAAGTTAAAC) agus AggDef-Tau 1 purified (Priant-3GC) agus AggDef-Tau 1 purified cultúir coli bhí tar éis fás go OD600 = 0.6–0.7 ag 37°C agus 180 rpm, agus tionscnaíodh slonn le IPTG ar feadh 3 huaire ag 37°C.Bain cealla ag 11,500 xg ar feadh 15 nóiméad ag 4 °C agus nigh le maolán salanda ina bhfuil 150 mM NaCl.Cuir an millín ar athchromadh i maolán lysis (20 ml in aghaidh 1 L LB: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, beinsimídín 50 μM, copeptin 100).Rinneadh an chéim sonication ar oighear le aimplitiúid de 80% ar feadh 10 bíoga (1 nóiméad ar, 1 min as).Ná níos mó ná 60 ml in aon ultrafhuaime amháin.Téiteadh lysates E. coli ag 95 ° C. ar feadh 20 nóiméad, ansin fuaraíodh iad ar oighear agus lártheifneoiríodh iad ag 127,000 × g ar feadh 40 nóiméad.Cuireadh an forshnáthán soiléirithe i bhfeidhm ar membrane 3.5 kDa (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, RA) agus scagdhealaíodh é i gcoinne 4 L de mhaolán scagdhealaithe (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM , PMSF 0.1 mM) ar feadh 10 n-uaire.Rinneadh colún malairte cation 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) le maolán cothromaíochta (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Scagadh an tau lysate trí scagaire PVDF 0.22 μm agus instealladh isteach sa cholún ag ráta sreafa 1 ml/nóiméad.Rinneadh elution de réir a chéile, bhí tau eluted le maolán elution 15-30% (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Rinne SDS-PAGE anailís ar chodáin, agus díríodh aon chodáin ina raibh banda amháin leis an meáchan móilíneach tau tuartha ag baint úsáide as scagaire lártheifneora 10 kDa agus cuireadh maolán ina n-ionad ina raibh 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM agus DTT 2 mM le haghaidh ba é an tiúchan próitéin deiridh ná 100 μM.Ansin cuireadh an tuaslagán próitéine trí scagaire PVDF 0.22 μm, reoite go tapa agus stóráilte ag -80 °C.Chuir an tOllamh Alberto Boffi Próitéin K18 ar fáil go cineálta.Ba é >95% íonacht an ullmhúcháin mar a dheimhnigh SDS-PAGE agus MALDI-TOF/TOF.Rinneadh cistéiní éagsúla a lipéadú go ceimiceach le AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, SAM) nó TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Ceanada).deimhníodh trí ionsúchán agus MALDI-TOF/TOF.Rinneadh Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau agus K18 a lipéadú le hiarmhair cistéineach dúchais ag poist 191 agus 322 ag baint úsáide as Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, an Ghearmáin) tar éis an nós imeachta céanna.Gintear muirear glan in aghaidh na léarscáileanna iarmhair do αS agus Tau441 ag baint úsáide as CIDER66.
Soladach polai-L-lísín (pLK DP 90-110 de réir NMR ó sholáthraí, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, SAM) a dhíscaoileadh i 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 go 10 mM tiúchan, próiseas sonicated ar feadh 5 nóiméad i ndabhach uisce ultrasonaic agus stóráil ag -20 ° C.Tá PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) agus FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, SAM) intuaslagtha in uisce agus scaipthe go forleathan i maolán LLPS.Baineann scagdhealú salainn éillitheacha.Rinneadh iad a scagadh ansin trí scagaire steallaire le méid pore de 0.22 μm, agus ríomhadh a dtiúchan ag baint úsáide as refractometer (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, SAM).Ullmhaíodh samplaí LLPS ag teocht an tseomra san ord seo a leanas: meascadh maolán agus easbhrúite agus 1 mM tris(2-carboxyethyl)fosphine (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Eatán- 1, 2-diyldinitrile) aigéad tetraaicéiteach (EDTA, carboxynth) agus meascán d'inhibitor protease 1% (PMSF 100 mM, beinsimíd 1 mM, leupeptin 5 μM).Ansin cuirtear αS agus polycations comhleáite (roghanna pLK nó Tau).Le haghaidh turgnaimh sraith ama thioflavin-T (ThT, Carbosynth, Compton, UK), bain úsáid as an tiúchan ThT iomlán mar leath an tiúchan αS.Measc na samplaí go réidh ach go críochnúil lena chinntiú go bhfuil siad aonchineálach.Bhí tiúchan gach comhpháirte éagsúil ó thurgnamh go turgnamh, mar a chuirtear síos air i rannán na dTorthaí.Baineadh úsáid as azíd ag tiúchan 0.02% (w/v) aon uair a sháraigh fad an turgnaimh 4 huaire an chloig.I gcás gach anailíse a úsáideann samplaí LLPS, lig don mheascán cothromaíocht a dhéanamh ar feadh 5 nóiméad roimh anailís.Le haghaidh anailíse scaipthe solais, lódaíodh 150 µl samplaí ar mhicreaphlátaí neamhcheangailteacha 96 tobar (µClear®, dubh, F-Bun/Tobar an tSimléir, Greiner bith-amháin, Kremsmünster, an Ostair) agus clúdaíodh iad le scannán greamaitheach.Rinneadh monatóireacht ar LLPanna trí ionsúchán a thomhas ag 350 nm i lár an réitigh i léitheoir pláta CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, an Ghearmáin).Rinneadh na turgnaimh i dtrí chóip ag 25°C, agus ríomhadh na hearráidí mar an diall caighdeánach ón meán.Rinneadh an chéim caolaithe a chainníochtú trí lártheifneoiriú samplach agus anailís glóthach SDS-PAGE, agus rinneadh an codán αS sna céimeanna caolaithe agus tiubhaithe a chainníochtú i réitigh LLPS éagsúla.Ullmhaíodh sampla LLPS 100 μl ina raibh 1 μM AF488-lipéadaithe αS trí mheascadh críochnúil agus ina dhiaidh sin lártheifneoiriú ag 9600 × g ar feadh 30 nóiméad, agus ina dhiaidh sin bhí an deascán le feiceáil de ghnáth.Baineadh úsáid as an 50 μl is airde den shástán le haghaidh cainníochtú próitéine ag baint úsáide as glóthach SDS-PAGE.Scanadh glóthacha le scagairí AF488 ag baint úsáide as córas íomháithe glóthacha ChemiDoc (Saotharlanna Bio-Rad, Hercules, CA, SAM) nó dhaite le stain Coomassie agus léirshamhlú le scagairí cuí.Rinneadh anailís ar na bandaí a d'eascair as seo agus úsáid á baint as ImageJ version 1.53i (Institiúidí Náisiúnta Sláinte, SAM).Rinneadh na turgnaimh i ndúblach in dhá thurgnamh éagsúla le torthaí comhchosúla.
De ghnáth, cuireadh 150 μl de shamplaí i bhfeidhm ar mhicreaphlátaí neamhcheangailteacha 96-tobar agus léiríodh iad ag teocht an tseomra ar mhicreascóp inbhéartaithe Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, an Ghearmáin).Le haghaidh turgnaimh ar an láthair, úsáideadh plátaí Angiogenesis µ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, an Ghearmáin) nó micreaphlátaí polaistiréin 96-tobar (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) freisin.Baineadh úsáid as lampaí hailíde miotail halaigine nó mearcair EL6000 mar fhoinsí soilsithe (le haghaidh íomháú BF/DIC agus WF, faoi seach).Maidir le micreascópacht WF, baineadh úsáid as cuspóir aeir méadaithe 40x (Leica Microsystems, an Ghearmáin) chun an solas a dhíriú ar an sampla agus é a bhailiú.I gcás samplaí lipéadaithe AF488 agus ThT, scagairí excitation agus astaíocht le tacair chaighdeánacha scagaire GFP, scagairí pasbhanna scoite agus astaithe, faoi seach, scagairí bandpass 460-500 nm agus 512-542 nm, agus scáthán déchróiceach 495 nm.I gcás samplaí atá lipéadaithe le Atto647N, baineadh úsáid as sraith chaighdeánach de scagairí Cy5 le scagairí pasbhanna banda excitation agus astaithe 628-40 nm agus 692-40 nm, faoi seach, agus scáthán déchróic 660 nm.Le haghaidh micreascópachta BF agus DIC, bain úsáid as an gcuspóir bailithe solais frithchaite céanna.Taifeadadh an solas bailithe ar cheamara CCD Leica DFC7000 (Leica Microsystems, an Ghearmáin).Ba é an t-am nochta ná 50 ms le haghaidh íomháú micreascópachta BF agus DIC agus 20-100 ms le haghaidh íomháú micreascópachta WF.Chun comparáid a dhéanamh, ba é 100 ms an t-am nochta do gach turgnamh le ThT.Rinneadh turgnaimh imeacht ama chun comhtháthú braoiníní a léirshamhlú, agus bailigh íomhánna gach 100 ms ar feadh roinnt nóiméad.Baineadh úsáid as ImageJ (NIH, SAM) le haghaidh anailíse íomhá.Rinneadh na turgnaimh i dtrí chóip le torthaí comhchosúla.
Le haghaidh turgnaimh comhláraithe, FRAP agus atógáil 3D, fuarthas íomhánna ar mhicreascóp comhfhócasach inbhéartaithe Zeiss LSM 880 ag baint úsáide as eagrán gorm ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, an Ghearmáin).Cuireadh samplaí de 50 µl i bhfeidhm ar miasa µ-Slide Angiogenesis Petri (Ibidi GmbH, Gröfelfing, an Ghearmáin), cóireáilte le polaiméir hidreafhile (ibiTreat) agus gléasta i gcuspóir tumoideachais ola 63 × (Plan-Apochromat 63 × / NA 1.4 Oil) ar DIC).Fuarthas íomhánna ag baint úsáide as línte léasair argón 458 nm, 488 nm, agus 633 nm le taifeach 0.26 µm / picteilín agus am nochta de 8 µs / picteilín le haghaidh fuinneoga excitation agus braite astaíochtaí 470-600 nm, 493-628 nm, agus úsáideadh 638–755 nm chun ThT, AF488 agus Atto647N faoi seach a léirshamhlú.I gcás na dturgnaimh FRAP, taifeadadh grianghrafadóireacht imeacht ama de gach sampla ag 1 fhráma in aghaidh an tsoicind.Rinneadh na turgnaimh faoi thrí ag teocht an tseomra le torthaí comhchosúla.Rinneadh anailís ar na híomhánna go léir ag baint úsáide as bogearraí eagrán gorm Zen 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, an Ghearmáin).Rinneadh na cuair FRAP a normalú, a bhreacadh agus a fheistiú ar shonraí déine/ama a bhaintear as íomhánna ag baint úsáide as Zen 2 ag baint úsáide as OriginPro 9.1.Feistíodh na cuair aisghabhála ar mhúnla mona-easpónantúil chun idirleathadh móilíneach a áireamh le téarma easpónantúil breise chun cuntas a thabhairt ar an éifeacht tuaradh éadála.Rinneamar D a ríomh ansin ag baint úsáide as an ga tuaradh ainmniúil agus an leathré téarnaimh a socraíodh roimhe seo mar atá i gcothromóid Kang et al.5 35 léirithe.
Rinneadh leaganacha cistéin aonair de αS a shintéisiú le 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) ag poist 24 (TEMPOL-24-αS) agus 122 (TEMPOL-122-αS), faoi ​​seach.Lipéadú Casadh I gcás turgnaimh EPR, socraíodh an tiúchan αS ag 100 μM agus ba é an tiúchan PEG ná 15% (w/v).I gcás coinníollacha comhiomlánaithe éagsúla, ba é an cóimheas αS:pLK ná 1:10, agus coinníodh na cóimheasa αS: ΔNt-Tau agus αS:Tau441 ag 1:1.Le haghaidh turgnaimh toirtmheasctha ceangailteach in éagmais plódaithe, coinníodh TEMPOL-122-αS ag 50 μM agus rinneadh polacations a thoirtmheascadh ag tiúchan méadaithe, ag ullmhú gach coinníoll ar leithligh.Rinneadh tomhais CW-EPR ag baint úsáide as speictriméadar X-bhanna Bruker ELEXSYS E580 atá feistithe le athshonadóir Bruker ER4118 SPT-N1 a oibríonn ag minicíocht micreathonn (SHF) de ~9.7 GHz.Socraíodh an teocht ag 25°C agus rialaíodh í le crióstat nítrigine leachtach.Fuarthas na speictrim faoi choinníollacha neamhsháithithe ag cumhacht MW de 4 mW, aimplitiúid modhnúcháin de 0.1 mT, agus minicíocht modhnú 100 kHz.Gnáthaíodh déine speictreach chun difríochtaí i dtiúchan casadh idir samplaí agus laghdú casadh féideartha a sheachaint mar gheall ar thiúchan iarmharach gníomhairí laghdaithe i samplaí ina bhfuil Tau441 nó ΔNt-Tau (i láthair sna réitigh próitéin bunaidh).Fuarthas na luachanna tugtha g mar thoradh ar shamhaltú speictreach EPR a rinneadh ag baint úsáide as na bogearraí Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) a cuireadh i bhfeidhm i Matlab®67.Baineadh úsáid as samhlacha iseatrópacha comhpháirt amháin/dó chun na sonraí a shamhaltú.Tar éis na comharthaí go léir a normalú, ríomhadh na hiarmhairtí trí gach insamhalta a dhealú ón speictream turgnamhach comhfhreagrach.Le haghaidh anailíse toirtmheasctha ceangailteach, baineadh úsáid as déine choibhneasta an tríú banda leis an dara banda den speictream normalaithe EPR (IIII/III) chun monatóireacht a dhéanamh ar cheangal na n-polacations le αS.Chun an tairiseach díthiomsaithe (Kd) a mheas, feistíodh an cuar a bhí mar thoradh air ar shamhail neas ag glacadh leis go raibh n suíomh ceangailteach comhionann agus neamhspleách.
Rinneadh turgnaimh speictreascópachta NMR ag baint úsáide as speictriméadar NMR Bruker Neo 800 MHz (1H) a bhí feistithe le crióprób agus grádán Z.Rinneadh na turgnaimh go léir ag baint úsáide as 130-207 µM αS agus coibhéisí comhfhreagracha αS / ΔNt-Tau agus pLK i 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 agus rinneadh iad ag 15 ° C.Chun monatóireacht a dhéanamh ar LPS de réir NMR, cuireadh 10% PEG leis na samplaí réamh-mheasctha.Léiríonn an plota suaitheadh ​​​​an t-aistriú ceimiceach (Fíor 1b) an meán shifts ceimiceacha 1H agus 15N.Sannadh speictream αS 2D1H-15N HSQC bunaithe ar thasc roimhe seo (iontráil BMRB #25227) agus deimhníodh iad trí speictream 3D HNCA, HNCO agus CBCAcoNH a thaifeadadh agus a anailísiú.Ríomhadh shifts ceimiceacha 13Cα agus 13Cβ i láthair ΔNt-Tau nó pLK chun athruithe féideartha ar threochtaí struchtúir tánaisteacha a thomhas i gcomparáid le shifts ceimiceacha αS i gcomhfhoirmiú coil randamach íon 68 (Fíor Forlíontach 5c).Rinneadh na rátaí R1ρ a thomhas trí thurgnaimh hsqctretf3gpsi a thaifeadadh (a fuarthas ó leabharlann Bruker) le moilleanna 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, agus 800 ms, agus coigeartaíodh na feidhmeanna easpónantúla chuig na moilleanna buaicdéine ag éagsúla. amanna chun an R1ρ agus a neamhchinnteacht turgnamhach a chinneadh.
Rinneadh turgnaimh mhicreascópachta fhluaraiseachta dhá dhath réitithe am ar mhicreascóp comhfhócasach fluaraiseachta MT200 réitithe am tráchtála (PicoQuant, Beirlín, an Ghearmáin) le gléas comhairimh fótóin aonair (TCSPC) a bhfuil comhghaolú ama aige.Úsáidtear an ceann dé-óid léasair le haghaidh excitation idirdhuilleach bíogach (PIE), téann an bhíoma trí thonnthreoir modh aonair agus tá sé tiúnta le cumhacht léasair de 10 go 100 nW le haghaidh línte léasair 481 nm agus 637 nm arna dtomhas tar éis scáthán déchroic.Cinntíonn sé seo an ráta comhairimh fótóin is fearr, rud a sheachnaíonn éifeachtaí ailiasú fótóin, fótaisithe agus sáithiúcháin.Cuireadh clúdaigh nó plátaí clúdaigh angiogenesis μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, an Ghearmáin) go díreach san uisce tumoideachais thar lionsa Super Apochromat 60x NA 1.2 le coiléar ceartaitheach (Olympus Life Sciences, Waltham, SAM).Baineadh úsáid as scáthán déchroic 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, SAM) mar phríomh-scoilteoir bíomaí.Tá poll le trastomhas de 50 miocrón ag radaíocht neamhfhócasach, ansin roinntear an radaíocht dhírithe ina 2 chosán braite ag scoilteoir bhíoma 50/50.Baineadh úsáid as scagairí astaithe pas-bhanna (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 le haghaidh dath glas (AF488) agus 690/70 le haghaidh dath dearg (Atto647N) os comhair an bhrathadóra.Úsáideadh dé-óid aonfhótatóin (SPAD) (Feistí Micreafótóin, Bolzano, an Iodáil) mar bhrathadóirí.Baineadh úsáid as na bogearraí SymphoTime64 atá ar fáil ar bhonn tráchtála (PicoQuant GmbH, Beirlín, an Ghearmáin) a bhailiú agus a anailísiú sonraí araon.
Cuireadh caoga microlitr de shamplaí LLPS i bhfeidhm ar thoibreacha angiogenesis μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, an Ghearmáin).Dírítear na híomhánna dá bharr go 20 µm os cionn an bhun tobair don achar oibre oibiachtúil is fearr do bhraoiníní ar fuaidreamh agus go dtí ~1 µm do raftaí agus poncanna le taifeach aiseach de 0.25 µm/picteilín ar a laghad agus moill de 400 µs/picteilín.Roghnaigh sonraí trí thairseach déine a chur i bhfeidhm bunaithe ar an meándéine comhartha cúlra (PBG, meán + 2σ) do gach cainéal ionas nach roghnófar ach braoiníní, raftaí nó spotaí próitéin leachtacha, ag scagadh amach aon bhunús féideartha ón gcéim scaipthe.Chun anailís a dhéanamh ar shaolré gach speiceas (τ) de gach cainéal (glas, “g” le haghaidh AF488 agus dearg, “r” le haghaidh Atto647N), roghnaigh muid réigiúin spéise (ROI) ina raibh braoiníní, raftaí, nó spotaí (Figiúr Forlíontach 1). ).8b) agus díorthaíodh iad trí mheath a saoil a fheistiú (τD, τR agus τP le haghaidh braoiníní, raftaí nó spotaí, faoi seach, féach Fíor Fhorlíontach. 8c) i ngach cainéal ag baint úsáide as anailís eireabaill agus samhail lobhadh dhá chomhpháirt.Meán τ ó τ .Eisíodh san anailís ROIanna a tháirg róbheagán fótón le haghaidh feisteas il-easpónantúil.Ba é an scoite a úsáideadh ná <104 fótón le haghaidh raftaí agus poncanna agus 103 le haghaidh braon.Tá tairseach níos ísle ag na braoiníní toisc go bhfuil sé deacair cuair lobhadh a fháil le luachanna déine níos airde, ós rud é go mbíonn na braoiníní i réimse na híomhá níos lú agus níos lú de ghnáth.Caitheadh ​​amach freisin le haghaidh anailíse ar ROIanna le háirimh fótóin os cionn na teorann carntha fótóin (socraithe go >500 comhaireamh/picteilín).Meaitseáil an cuar lobhadh déine a fhaightear ón réigiún spéise le déine ag 90% den uasmhéid (beagán tar éis déine uasta an lobhadh) ó thús shaol na seirbhíse chun cur isteach íosta IRF a chinntiú agus an rud céanna á choinneáil do gach lobhadh déine. socruithe Fuinneog ama choibhneasta Rinneadh anailís ar 25 go 50 ROI le haghaidh raftaí agus spotaí agus 15-25 ROI le haghaidh braon, taifeadadh íomhánna a roghnaíodh as níos mó ná 4 mhacasamhlú ó 3 thurgnaimh neamhspleácha ar a laghad.Baineadh úsáid as t-tástáil dhá earr chun difríochtaí staitistiúla idir speicis nó idir córais coacervate a mheas.Le haghaidh anailíse picteilín-ar-phicteilín ar an saolré (τ), ríomhadh an tanú iomlán ar an saolré thar an réimse do gach cainéal agus rinneadh comhfhogasú ar shamhail tanúcháin easpónantúil 2/3-chomhpháirt.Feistíodh an maolú saoil do gach picteilín ansin ag baint úsáide as luachanna τ a ríomhadh roimhe seo, rud a d'fhág go raibh íomhá oiriúnach FLIM pseudodhathach.Bhí an raon saoil feisteas eireaball mar an gcéanna ar fud na n-íomhánna go léir den chainéal céanna, agus tháirg gach lobhadh go leor fótón chun oiriúnach iontaofa a sholáthar.Le haghaidh anailíse FRET, roghnaíodh picteilíní trí thairseach déine níos ísle de 100 fótón a chur i bhfeidhm, arbh ionann é agus comhartha cúlra (FBG) de 11 fhótón ar an meán.Ceartaíodh déine fluaraiseachta gach cainéal ag fachtóirí ceartúcháin a chinntear go turgnamhach: ba é 69 crosstalk α speictreach 0.004, bhí excitation díreach β 0.0305, ba é éifeachtacht braite γ 0.517.Ríomhtar an éifeachtúlacht FRET ag an leibhéal picteilín ansin ag baint úsáide as an gcothromóid seo a leanas:
i gcás gurb é FDD an déine fhluaraiseachta a breathnaíodh sa chainéal deontóra (glas), is é FDA an déine fluaraiseachta a breathnaíodh sa chainéal glacadóir (dearg) faoi excitation indíreach, agus is é FAA an déine fluaraiseachta a breathnaíodh sa chainéal glacadóir (dearg) faoi excitation díreach. PIE).Breathnaítear bíoga déine fluaraiseachta sa chainéal).
Cuir 100 µl de thuaslagán imoibrithe LLPS ina bhfuil 25 µM monaiméireach Tau441 neamhlipéadaithe (le 25 µM αS nó gan é) i maolán LLPS (arna fhorlíonadh mar atá thuas) ar mhicreaplaí neamhcheangailteacha 96-tobair le sciath scragall greamaitheacha agus rinne micreascópacht WF seiceáil ar fhoirmiú braoiníní ina dhiaidh sin. cothromaíochta.laistigh de 10 nóiméad.Tar éis 48 uair an chloig goir ag teocht an tseomra, deimhníodh láithreacht raftaí agus spotaí próitéine.Ansin bain go cúramach an leacht thar na raftaí ó na toibreacha, ansin cuir 50 L de mhaolán díthiomsaithe (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) agus gor ar feadh 10 nóiméad.Cinntíonn an tiúchan ard salainn nach dtiocfaidh LLPS arís mar gheall ar PEG iarmharach, agus déanfar tionóil próitéine féideartha a fhoirmítear ach amháin trí idirghníomhaíochtaí leictreastatacha a dhíchóimeáil.Scríobadh bun an tobair ansin go cúramach le tip micripipéad agus aistríodh an tuaslagán a tháinig as go dtí tobar faire folamh.Tar éis gor na samplaí le 50 μM ThT ar feadh 1 h, rinne micreascópacht WF seiceáil ar láithreacht spotaí iargúlta.Ullmhaigh fibrilí αS sonicated trí 300 µl de thuaslagán 70-µM αS a chothú i PBS le pH 7.4, aigéad sóidiam 0.01% ag 37 °C agus 200 rpm ar fhithiseán ar feadh 7 lá.Ansin lártheifníodh an réiteach ag 9600 × g ar feadh 30 nóiméad, athchuireadh an millíní i PBS pH 7.4 agus sonicated (1 min, timthriall 50%, aimplitiúid 80% i sonicator Vibra-Cell VC130, Sonics, Newton, USA) samplaí fibril le dáileadh méid sách aonfhoirmeach de fibrilí beaga.
Rinneadh anailís FCS/FCCS agus braite comhtharlú dhá-dath (TCCD) ar an micreascóp comhfhócasach fluaraiseachta am-réiteach MT200 céanna (Pico-Quant, Beirlín, an Ghearmáin) a úsáideadh do thurgnaimh mhicreascópachta FLIM-FRET ag baint úsáide as an modh PIE.Cuireadh an chumhacht léasair do na turgnaimh seo le 6.0 µW (481 nm) agus 6.2 µW (637 nm).Roghnaíodh an teaglaim de na cumhachtaí léasair seo chun gile comhchosúil a tháirgeadh do na péirí fluairafóir a úsáideadh agus na rátaí comhairimh is fearr a bhaint amach agus fóta-thuartha agus sáithiú a sheachaint.Baineadh úsáid as na bogearraí SymphoTime64 leagan 2.3 atá ar fáil ar bhonn tráchtála (PicoQuant, Beirlín, an Ghearmáin) a bhailiú agus a anailísiú araon.
Caolaítear samplaí de chomhiomláin αS/Tau scoite a fhaightear ag baint úsáide as LLPS i maolán leithlisithe go dtí an tiúchan monamhóilíneach cuí (caolú 1:500 go hiondúil, ós rud é go bhfuil comhiomláin ag tiúchan íseal cheana féin nuair a scoitetar iad ó shamplaí coacervate).Cuireadh samplaí díreach i bhfeidhm ar dhuillíní clúdaigh (Corning, SAM) réamhbhrataithe le tuaslagán BSA ag tiúchan 1 mg/mL.
Maidir leis an anailís PIE-smFRET ar na bealaí glasa agus dearga, cuireadh tairseach déine níos ísle de 25 fótón i bhfeidhm chun comharthaí déine íseal de bharr teagmhais mhonaiméireacha a scagadh amach (tabhair faoi deara go bhfuil monaiméirí níos mó ná samplaí comhiomlánaithe i gcomparáid le comhiomláin scoite).Ríomhadh an tairseach seo mar chúig huaire an mheándéine de αS monaiméireach a fuarthas ó anailís ar shamplaí monaiméirí íona chun comhiomláin a roghnú go sonrach le haghaidh anailíse.Chuir ciorcad tiomána PIE, mar aon le fáil sonraí TSCPC, ar chumas scagaire ualaithe ar feadh an tsaoil a chur i bhfeidhm a chuidíonn le deireadh a chur le trastalk cúlra agus speictreach.Ceartaíodh an déine bladhmanna a roghnaíodh agus na tairseacha thuas á n-úsáid ag baint úsáide as an meánchomhartha cúlra arna chinneadh ó na histeagraim tarlaithe in aghaidh déine/araid na samplaí maolánacha amháin.Is gnách go mbíonn pléascanna a bhaineann le comhiomláin mhóra i roinnt boscaí bruscair i ndiaidh a chéile sa rian ama (socraithe go 1 ms).Sna cásanna seo, roghnaíodh bosca bruscair a raibh an neart uasta aige.Le haghaidh anailíse FRET agus stoichiometric, baineadh úsáid as an fachtóir gáma γ (0.517) a cinneadh go teoiriciúil.Tá ranníocaíochtaí crosstalk speictreach agus excitation díreach neamhbhríoch (arna chinneadh go turgnamhach) ag an gcumhacht léasair excitation a úsáidtear.Ríomhtar éifeachtúlacht agus stoichiometry FRET i bpléasc mar seo a leanas.