310 10*1mm Feadánra coiled cruach dhosmálta Comhpháirt cheimiceach, Na fearainn N-críochfort de spidroin foirm hidrogels bunaithe ar fhibrilí amyloid agus ardán a sholáthar do díluailithe próitéine.

Go raibh maith agat as cuairt a thabhairt ar Nature.com.Tá tú ag baint úsáide as leagan brabhsálaí a bhfuil tacaíocht CSS teoranta aige.Chun an taithí is fearr a fháil, molaimid duit brabhsálaí nuashonraithe a úsáid (nó Mód Comhoiriúnachta a dhíchumasú in Internet Explorer).Ina theannta sin, chun tacaíocht leanúnach a chinntiú, taispeánann muid an suíomh gan stíleanna agus JavaScript.
Sleamhnáin a thaispeánann trí alt in aghaidh an tsleamhnáin.Bain úsáid as na cnaipí cúil agus seo chugainn chun bogadh tríd na sleamhnáin, nó na cnaipí rialtóra sleamhnáin ag an deireadh chun bogadh trí gach sleamhnán.

Sonraíocht

310 10*1mm soláthraithe feadáin coiled cruach dhosmálta

Comhdhéanamh Ceimiceach

Airíonna Meicniúla

Tá go leor feidhmchlár féideartha ag próitéiní síoda damháin alla athchuingreach (próitéiní síoda damháin alla) i bhforbairt bithábhair nua, ach déanann a nádúr ilmhódach agus comhiomlánaithe deacair iad a fháil agus éasca le húsáid.Tuairiscímid anseo go ndéanann mionphróitéiní spidroin athchuingreach agus, níos tábhachtaí fós, go gcruthaíonn an fearann ​​N-críochfort (NT) é féin go tapa hidrigilití féinchothaitheacha trédhearcacha ag 37 °C.próitéiní comhleá comhdhéanta de NT agus próitéin fluaraiseacha glas nó purine nucleoside phosphorylase foirmíonn próitéiní comhleá lánfheidhmiúil.Hidrigéil.Léiríonn ár dtorthaí go soláthraíonn próitéiní NT agus comhleá athchuingreach táirgeacht ardléirithe agus hidrigilití dearlaice le hairíonna tarraingteacha cosúil le trédhearcacht, geiliú gan trasnasc, agus díluailithe díreach próitéiní gníomhacha ag ard-dlúis.
Tá suas le seacht sraith dhifriúla faireoga síoda ag damháin alla, gach ceann acu ag táirgeadh cineál sonrach síoda.Tá gach ceann de na seacht speiceas síoda comhdhéanta de phróitéiní síoda damháin alla (spidroins) thart ar 6000 iarmhair ar fad agus tá réigiún mór athfhillteach lárnach timpeallaithe ag fearainn sféarúla N- agus C-teirminéal (NT agus CT)1,2.Is é an cineál síoda is mó a ndéantar staidéar air, an t-ampulla príomhúil, a tháirgtear ag an gland ampula bunscoile.Sa fhaireog seo, déanann monolayer de chealla epithelial próitéiní spidroin a shintéisiú agus iad a scaoileadh isteach i lumen na faireoga, áit a bhfuil siad i láthair i bhfoirm intuaslagtha (dhópála) ag tiúchan an-ard (30-50% w/v)3,4.Tá plé déanta ar eagrú agus ar chomhfhoirmiú na bpríomhphróitéiní spidroin ampullar sa fhaireog, ach léiríonn an chuid is mó den fhianaise thurgnamhach go bhfuil comhfhoirmiú helical ginearálta agus/nó randamach i láthair agus struchtúir micellar nó lamellar5,6,7,8,9,10.Cé go rialaíonn na fearainn athchleachtach airíonna meicniúla snáithíní síoda, ag foirmiú nanocrystals β-bhileog agus struchtúir éagruthacha11,12,13,14,15, rialaíonn fearainn deiridh snáithíní síoda mar fhreagra ar choinníollacha athraitheacha feadh an fhaireog síoda16,17,18.Trí fhoirmiú síoda a rialú, 19. caomhnaítear fearainn chríochfoirt go héabhlóideach agus d’fhéadfadh a bhfeidhm a bheith comónta do gach próitéin spidroin 2,20,21.Le linn a bheith ag dul tríd an bhfaireog, laghdaítear pH an spidroin ó thart ar 7.6 go < 5.716 agus méadaíonn sé le lomadh agus stráice arna idirghabháil ag gluaiseacht tríd an ducht cúngaithe de réir a chéile.Mar réiteach, is dimer17 comhthreomhar comhdhéanamh α-helical é CT, ach mar fhreagra ar pH íseal agus fórsaí lomadh, leathnaíonn CT agus lasca β-sraitheanna16, 17, b'fhéidir ag spreagadh β-sraitheanna i réigiúin athchleachtach Tiontaigh 16. Tá NT monaiméireach faoi. coinníollacha a léiríonn coinníollacha i lumen an fhaireog agus a mheánn tuaslagthacht an spidroin, ach ag pH laghdaithe, mar thoradh ar phrótónú ar roinnt slabhraí d'aigéad carbocsaileach laghdú ar NT le pKa de thart ar 6.5, rud a chobhsú NT agus a shocrú spidroin mór. cainníochtaí.líonraí16,18.Mar sin, tá ról lárnach ag NT i bhfoirmiú filiméid, ag athrú ó mhonaiméir sa bhratú go dimer sa snáithín23,24,25.Tá NT fós an-intuaslagtha agus héiliciúil faoi na coinníollacha go léir a ndearnadh staidéar orthu go dtí seo16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, rud a spreag a fhorbairt mar lipéad a fheabhsaíonn intuaslagthacht do tháirgeadh próitéiní heitrologacha.
Tá mionphróitéin athchuingreach síoda damháin alla, comhdhéanta de NT amháin, réigiún athfhillteach gearr amháin, CT amháin, agus clib His6 (His-NT2RepCT) le haghaidh íonú, chomh intuaslagtha i maolán uiscí is atá próitéin síoda damháin alla dhúchais agus mimics tréithe tábhachtacha dúchasacha an damháin alla síoda. .clúdach 25.31.Is féidir His-NT2RepCT a sníomh isteach i snáithíní leanúnacha ag baint úsáide as meaisín bithmhiméadach ina ndéantar sciath intuaslagtha pH 8 a easbhrú isteach i ndabhach uisce pH 525,32,33,34,35.Bhí toradh >14 g/L tar éis íonúcháin mar thoradh ar choipeadh bith-imoibreora E. coli a léirigh His-NT2RepCT agus iarchóireáil ina dhiaidh sin.Cuirtear ard-toradh, tuaslagthacht ard, agus freagairt imleor His-NT2RepCT do dhálaí aigéadacha go léir i leith NT23, 25, 34.
Anseo tuairiscímid foirmiú tapa hidrigilití trédhearcacha ó phróitéiní spidroin athchuingreach, lena n-áirítear NT amháin, trí thuaslagán próitéine a chothú ag 37 °C.Trí úsáid a bhaint as fluaraiseacht thioflavin T (ThT), chlaochlaíonn Fourier speictreascópacht infridhearg (FTIR), speictreascópacht athshondais mhaighnéadaigh núicléach (NMR) agus micreascópacht leictreoin tarchurtha (TEM), fuaireamar amach go ndéantar claochlú struchtúrach ar phróitéiní NT agus micrea-dhomhain ina leatháin β agus fibrilí cosúil le amyloid. nuair a fhoirmítear glóthacha.Ina theannta sin, foirmíonn próitéiní comhleá de NT agus próitéin fluaraiseacha glas (GFP) nó purine nucleoside phosphorylase (PNP) hidrogels le blúirí comhleá lánfheidhme.Osclaíonn léiriú ard-thréchur in óstaigh heitreolaíoch, in éineacht le foirmiú tapa hidrigéil faoi choinníollacha fiseolaíocha, an fhéidearthacht go bhféadfaí hidrigilití a tháirgeadh ar bhealach éifeachtach ó thaobh costais le feidhmeanna innealtóireachta.
Murab ionann agus an chuid is mó de na próitéiní spidroin athchuingreach a tuairiscíodh36, tá His-NT2RepCT cobhsaí i maolán Tris-HCl ag pH 8 agus is féidir é a chomhchruinniú suas le 500 mg/mL gan deascadh25.Mar sin, bhí ionadh orainn a fháil amach go gcruthaíonn an próitéin seo hidrigéilí féinchothaitheacha atá soiléir go optúil nuair a gortar iad ag 37°C (Fíor 1b-d).Léirigh staidéir bhreise gur tharla glóthú His-NT2RepCT thar raon leathan de thiúchan próitéine (10-300 mg / ml) agus go raibh comhghaolú contrártha ag an tiúchan seo le ham glóthaithe (Fíor. 1c agus Forlíontach Fíor. 1).Chun a fháil amach cé na codanna de His-NT2RepCT a mheánn foirmiú hidrigiléil, rinneamar scrúdú ansin ar gach fearann ​​ina aonar agus i gcomhcheangail éagsúla ag baint úsáide as measúnacht inbhéartaithe fleascáin (Fíor 1a,b).Gach codáin tástáladh de spidroin athchuingreach glóthacha déanta (ag tiúchan próitéin de 300 mg/ml) i níos lú ná 1 h, ach amháin i gcás deascadh 2 Rep (Fíor 1b).Tugann sé seo le tuiscint gur féidir le NT agus CT amháin, i dteannta a chéile, nó a bhaineann le hathchraoltaí, glóthach a dhéanamh ag 37°C agus nach mbíonn tionchar suntasach ag clib His6 ar an bpróiseas seo.Ag cur san áireamh an nóisean coitianta gur próitéin an-intuaslagtha agus cobhsaí é NT, agus go bhfuil éifeachtaí geilithe curtha i leith athruithe comhfhoirmithe i réigiúin athfhillteacha agus/nó CTanna i dtuarascálacha roimhe seo ar hidreagall spidroin athchuingreach, d'fhéadfadh NT féin.Bhí fionnachtain gelation gan choinne.Tábla Forlíontach 1) 37, 38, 39. Go hiontach, tá NT gelled cheana féin laistigh de 10 nóiméad ag tiúchan ≥ 300 mg/ml (Fíor 1c).Léirigh turgnaimh inbhéartaithe vial le tiúchain éagsúla NT go raibh an tuaslagán NT geolú níos tapúla ná His-NT2RepCT ag > 50 mg/mL ag an tiúchan comhfhreagrach (w/v, Fíor 1c).
Léiriú scéimreach de thógálacha éagsúla spidrín a ndearnadh staidéar orthu sa saothar seo.b Am glóthach ag 37 °C do phróitéiní éagsúla spidroin in-athchuingreach (300 mg/mL) arna bhfíorú tríd an vial a aisiompú.Glóthach CT láithreach gan gor (<300 mg/mL), deascán 2Rep (300 mg/mL, scála 5 mm).c Am glóthach His-NT2RepCT agus NT ag tiúchan léirithe próitéine ag 37°C.d Grianghraif de Hidrigéill His-NT2RepCT agus NT agus an damhán alla agus an litir “NT” priontáilte thíos, faoi seach (200 mg/mL araon, barra scála 5 mm).
Tá dathanna beagán difriúil ag hidrigéil arna bhfoirmiú ag próitéiní spidroin in-athchuingreach éagsúla, agus léiríonn breathnóireacht na súl naked leibhéil éagsúla trédhearcachta (Fíor 1b).Tá glóthacha NT thar a bheith soiléir agus éiríonn glóthacha eile teimhneach.D'fhéadfaí glóthacha His-NT2RepCT agus NT a caitheadh ​​isteach i bhfeadáin sorcóireacha a bhaint as an múnla slán (Fíor 1d).
Chun a thástáil cibé an glóthacha bratuithe síoda damháin alla nádúrtha faoi choinníollacha a fuarthas anois a bheith ina chúis le geileadh na próitéiní spidroin athchuingreach, bailíodh bratuithe ó fhaireog mór ampulla an damháin alla droichead Sualainnis (Larinioides sclopetarius).Stóráladh bratuithe i maolán Tris-HCl 20 mM ag 50 mg/mL (bunaithe ar mheáchan tirim tomhaiste), ach níor tugadh faoi deara aon geiliú le linn goir 21 lá ag 37 °C (Fíor Forlíontach 2a).
Chun na glóthacha seo a chainníochtú, is féidir tomhais sreabheolaíocha a úsáid chun staidéar a dhéanamh ar an bpróiseas geilithe agus chun na hairíonna meicniúla foriomlána a chinneadh.Go háirithe, is féidir le monatóireacht a dhéanamh ar an modúl stórála (leaisteachas) ag teochtaí ardaithe faisnéis a sholáthar maidir leis an teocht ghalaithe chomh maith le hairíonna viscoelastic an bhrataithe.Léirigh turgnaimh ardú teochta (ag baint úsáide as 1°C/min ag 25-45°C, bunaithe ar staidéir roimhe seo ag baint úsáide as réitigh stoic nádúrtha síoda)40,41 gur mhéadaigh modúil stórála réitigh His-NT2RepCT agus NT le méadú ar an teocht .(Fíor 2 agus Fíor Forlíontach 3).Go háirithe, thosaigh an modúl NT ag fás ag teocht níos ísle i gcomparáid le His-NT2RepCT, ag teacht leis an am glóthach níos tapúla a breathnaíodh nuair a goradh NT go díreach le His-NT2RepCT ag 37 ° C (Fíor 1).Tar éis titim teochta ina dhiaidh sin, níor fhill an modulus stórála ar luachanna níos ísle agus d'fhan sé os cionn an mhodúil caillteanais (féach Fíor Forlíontach 3), rud a léiríonn geiliú cobhsaí do-aisiompaithe go teirmeach.Tar éis geiliú, bhí an modulus leaisteacha deiridh sa raon ó 15 go 330 kPa le haghaidh hidrigéil His-NT2RepCT ag tiúchan 100–500 mg/mL, agus bhí an modulus leaisteach deiridh le haghaidh hidreagain NT (100–500 mg/mL) sa raon ó 2 go 1400 kPa (Fíor , 2 agus sonraí iomlána an rampaí) féach Fíor Forlíontach 3).
a Athrú teochta le linn tomhais His-NT2RepCT (300 mg/mL) agus b NT (300 mg/mL) le croitheadh.Léiríonn na saigheada an treocht teochta, agus léiríonn scáthú níos éadroime na sonraí modúl stórála tástáil ar luachanna chasmhóiminte níos ísle don ionstraim ná mar a shonraíonn an monaróir, agus is é sin an chúis atá leis an torann méadaithe.c Carnadh modúl deiridh His-NT2RepCT agus NT tar éis teocht ardaithe (100, 300, agus 500 mg/mL).Glactar gach léamh modúil ag minicíocht 0.1 Hz.
Mar mhodh féideartha le himscrúdú a dhéanamh ar athruithe comhfhoirmithe a bhaineann le geiliú, thaifeadamar speictream FTIR de His-NT2RepCT agus NT roimh agus tar éis geiliú ag 37°C (Fíor 3a,b).De réir mar a bhíothas ag súil leis, bhí speictream na dtuaslagán His-NT2RepCT agus NT ag freagairt do phróitéiní a thaispeánann struchtúr tánaisteach α-helix/corna randamach, le banda fhuaimnithe ag 1645 cm-1.Maidir leis an dá hidrogels, d'eascair geiliú le bunú dhá arm sa bhanna lár I ag thart ar 1617 cm-1 agus 1695 cm-1 (Fíor 3a, b), rud a léiríonn foirmiú struchtúir β-bhileog antiparallel.Is féidir na hathruithe seo a fheiceáil go soiléir freisin sa dara speictream geilithe díorthach agus difríochta faoi seach (Fíor Forlíontach 4b).Bhí an dá bhanda den NT β-ciseal níos suntasaí ná iad siúd de His-NT2RepCT, rud a thugann le fios go raibh ábhar iomlán na mbannaí β-ciseal sa hidrogel NT níos airde ná sin an hidrogel NT2RepCT.
speictream ionsúcháin FTIR de His-NT2RepCT agus b NT (500 mg/mL araon) roimh (tuaslagán) agus tar éis goir (glóthach) ag 37°C.c Íomhánna TEM de ghlóthaí NT2RepCT 50 mg/ml athfhionraí agus d NT.barra scála 200 nm.e Trastomhais shnáithíneacha de hidrigiléil His-NT2RepCT agus NT.n = 100 fibril tomhaiste, p < 0.0001.Léiríonn na barraí earráide an diall caighdeánach.Is é lár na mbarraí earráide an meán.Baineadh úsáid as t-tástáil gan péire (dhá eireaball) le haghaidh anailís staitistiúil.f Fluaraiseacht thT de phróitéiní éagsúla spidroin in-athchuingreach (100 mg/mL) ag 37 °C gan chroitheadh.g turgnaimh ionaclaithe NT (100 mg/mL) ó 100 mg/mL glóthach NT le síolta 0%, 5%, 10%, agus 20%.
Léirigh anailís ar an glóthach ag baint úsáide as micreascópacht leictreoin tarchurtha (TEM) go bhfuil an hidrogel comhdhéanta de fhibrilí cosúil le amyloid (Figs. 3c, 3d).Bhí fadaithe fibrilí NT-déanta (5-12 nm ar trastomhas) agus unbranched, cé go raibh a-NT2RepCT fibrils níos giorra ar fad agus i bhfad níos leithne ar trastomhas (7-16 nm) ( Fíor. 3e ).Cheadaigh na torthaí seo dúinn cinéitic na fiobróis a leanúint ag baint úsáide as an measúnacht Tioflaivin T (ThT).Maidir le gach próitéin spidroin athchuingreach, mhéadaigh an comhartha fluaraiseacha nuair a goradh samplaí ag 37 °C (Fíor 3f, Fíor Forlíontach 5a).Ag teacht leis an gcinneadh seo, léirigh scrúdú micreascópach ar NT agus His-NT2RepCT faoi choinníollacha glóthaithe méadú aonfhoirmeach ar fhluaraiseacht ThT gan carnadh áitiúil suntasach de chomhiomláin ThT-dearfach (Fíor Forlíontach 5b,c).Ní raibh méadú ar mhoirtiúlacht NT agus His-NTCT (Fíor Forlíontach 5d) ag gabháil le foirmiú fibrilí ThT-dearfach, rud a chiallaíonn go bhféadfadh líonra fibrilí sa fhoirmiú a fhoirmiú gan soiléireacht glóthach a chur i mbaol.Is féidir le síolú trí mhéideanna beaga fibrilí réamhfhoirmithe dlús suntasach a chur le foirmiú fibrilí roinnt amyloids42,43,44 ach ag cur 5%, 10% nó 20% (w/w) NT le tuaslagán hidrea-théachtach NT.éifeacht síolú (Fíor 3g).B'fhéidir go bhfuil sé seo mar gheall ar an bhfíric go bhfuil na fibrils sa hidrogel sách seasta agus nach féidir iad a úsáid mar shíolta.
Spreag iompar gan choinne próitéiní spidroin athchuingreach ag teochtaí arda tuilleadh staidéir ar speictreascópacht athshondais mhaighnéadaigh núicléach (NMR) chun athruithe comhfhoirmithe a bhaineann le foirmiú glóthacha a aithint.Léirigh speictream NMR de réitigh His-NT2RepCT a taifeadadh le himeacht ama ag 37°C go raibh CT fós fillte go páirteach, cé go raibh comharthaí NT agus 2Rep imithe (Fíor 4a), rud a thugann le tuiscint gurbh iad NT agus 2Rep den chuid is mó a rialaigh foirmiú His- Hidreagall NT2RepCT.Laghdaíodh an comhartha CT freisin go 20% dá dhéine bunaidh, rud a thugann le tuiscint go bhfuil CT socraithe agus ionchorpraithe den chuid is mó sa struchtúr hidrogel freisin.I gcás cuid níos lú den CT, atá chomh soghluaiste agus atá sa sampla réamh-ghoirte agus mar sin faoi deara ag réiteach NMR, tá easpa comharthaí speictrim don chéad 10 n-iarmhar struchtúrtha, b'fhéidir mar gheall ar dhíluailiú deacair ar an gcuid ceangailte de His-NT2Rep .Léirigh an speictream NMR de -staid na hidrogels -NT2RepCT láithreacht ceannasach α-helices agus β-sraitheanna agus, go pointe níos lú, an comhfhoirmiú corna randamach (Fig. 4b).Léirigh anailís aistrithe ceimiceach ar iarmhair meitiainín nach raibh i láthair ach in NT gur tiontaíodh an fearann ​​seo go struchtúr β-bhileog.Léirigh an speictream ag brath ar am NT i réiteach laghdú aonfhoirmeach ar dhéine comhartha (Fíor 4c), agus léirigh NMR soladach-stáit de hidrogels NT go ndearnadh an chuid is mó de na hiarmhair NT a thiontú go struchtúir β-bhileog (Fig. 4d).Níorbh fhéidir comhdhéanamh 2Rep a chinneadh go leithleach mar gheall ar a chlaonadh chun comhiomlán.Mar sin féin, bhí cuma an-chosúil ar speictream NMR soladstaide na hidrigéil NTCT agus His-NT2RepCT (Fíor 4b; Fíor Forlíontach 6b), rud a thugann le tuiscint gur beag a chuir 2Rep leis an gcuid struchtúrach den hidrogel His-NT2RepCT.Le haghaidh hidrogels CT, fuarthas amach go raibh α-helices, β-sheets, agus struchtúir tánaisteacha helical randamach ann (Fíor Forlíontach. 6d).Tugann sé seo le tuiscint go bhfanann codanna áirithe den CT ina α-helices agus go n-éiríonn cuid eile ina β-bhileoga.Mar sin, tugann torthaí speictreascópachta NMR le fios go bhfuil NT tábhachtach maidir le foirmiú hidrigine agus go n-aistrítear go cruth β-bhileog é freisin nuair a dhéantar é a chomhleá le 2Rep agus CT.Ag teacht leis seo, fuaireamar amach le déanaí gur dócha go gcruthóidh zippers spásúla amyloid i ngach ceann de na cúig héilí den fhearann ​​NT, agus thuar an algartam Válsa réigiún amyloidogenic i Helix 1 (Fíor 4e).
Speictream 2T de thuaslagán His-NT2RepCT 15N-HSQC 10 mg/mL roimh (gorm) agus 19 uair tar éis goir (dearg) ag 37°C.Sainítear crosbhuanna aonair sa speictream dearg agus F24, G136, polyA sa speictream gorm le siombailí aimínaigéad aonlitir agus uimhreacha iarmhair.Léiríonn na insets spleáchas na déine comhartha in am le haghaidh iarmhair roghnaithe ó na fearainn NT, 2Rep, agus CT.b speictrim radaimhinicíochta soladstaide (RFDR) de hidrigilití His-NT2RepCT.Socraíodh comhghaolta na n-iarmhar Cα/Cβ a breathnaíodh i speictrim RFDR trí chomparáid a dhéanamh le shifts ceimiceacha peptide múnla agus luachanna a dhíorthaítear ó staitisticí82,83 agus a struchtúir tánaisteacha.SSB – sideband rothlach.c Speictrim aontoiseach de thuaslagán 15N-HSQC 10 mg/mL NT le linn goir ag 37 °C ar feadh 36 uair an chloig.Léiríonn an inset déine toirtmhéadrach i gcomparáid le ham.d Speictream RFDR soladstaide de hidrigilití NT.Léirítear comhghaolta na n-iarmhar Cα/Cβ agus a struchtúir tánaisteacha a breathnaíodh sa speictrim RFDR.e Bunaithe ar phróifíl claonadh fibrilliúcháin NT45.79 ón mbunachar sonraí Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Taispeántar fuinneamh Rosetta i bhfuinneog sealaithe tintreach spásúil an heicseapeptide i kcal/mol.Ciallaíonn barraí dearga heicseaptídí a bhfuil ardchlaonadh fiobróis acu (fuinneamh Rosetta faoi -23 kcal/mol; faoi bhun na líne poncaithe).Léiríonn barraí glasa blúirí le fuinneamh Rosetta os cionn na tairsí agus dá bhrí sin is lú an seans go gcruthóidh siad zippers steiriúla.Ní raibh blúirí ina raibh proline eisiata ón anailís (gan colúin).Léiríonn cearnóga réimsí amyloidosis atá tuartha ag an algartam Válsa81 (https://waltz.switchlab.org).Tá seicheamh na n-iarmhar aimínaigéad NT ag an mbarr, agus léirítear na cineálacha iarmhair a fhaightear i struchtúr tánaisteach β (arna chinneadh ag speictreascópacht NMR soladach-stáit) i dearg.Ainmnítear suíomhanna na gcúig α-helices NT mar (H1-H5)28.
Ag pH <6.5, laghdaítear HT, agus é frithsheasmhach in aghaidh dínádúraithe de bharr teas nó úiré18.Chun a shoiléiriú cén tionchar a bhíonn ag maolú agus cobhsaíocht NT ar gheiliú, rialaíodh réitigh ina raibh 100 mg/ml NT ag pH 8, 7, agus 6 ag baint úsáide as an tástáil inbhéartaithe vial.Goradh samplaí NT ag pH 8 agus 7 gelled tar éis 30 nóiméad ag 37 °C, ach d'fhan an glóthach pH 8 soiléir, agus léirigh glóthach pH 7 deascán infheicthe (Fíor 5a).I gcodarsnacht leis sin, níor fhoirmiú i dtuaslagán ina raibh HT ag pH 6, agus d’fhéadfaí deascán mór a fheiceáil tar éis 20 nóiméad ag 37°C.Tugann sé seo le tuiscint go bhfuil maolú orthu féin agus/nó a gcobhsaíocht níos airde i gcomparáid le monaiméirí a choscann geiliú.Ní rabhthas ag súil le foirmiú deascán le haghaidh NT ag pH 7 agus 6, toisc go bhfuil sé tuairiscithe go bhfuil NT intuaslagtha ag 200 mg/ml27, go n-athfhillteann sé go héasca tar éis dínádúrú teasa, agus go gcoimeádann sé α-helix ag luachanna níos ísle de. pH 18. Míniú dóchúil ar na neamhréireachtaí seo is ea go ndearnadh na turgnaimh a tuairiscíodh roimhe seo ag teocht an tseomra nó faoi bhun, nó ag tiúchan próitéine atá measartha íseal16,18,19.
Tástáil inbhéartaithe vial NT (100 mg/mL) ag pH 8, 7, 6 agus 154 mM NaCl (pH 8) tar éis gortha ag 37°C.b speictream CD NT le agus gan 154 mM NaF agus 154 mM NaCl, faoi seach.Tiontaítear éilipseacht mhólar ag 222 nm go cion de fhillteacha nádúrtha.c Measúnacht inbhéartaithe NT (100 mg/mL) NT* (37 °C agus 60 °C), NTA72R (37 °C), agus His-NT-L6 (37 °C agus 60 °C).d speictream CD de shóiteáin NT NT*, NTA72R, agus His-NT-L6.Tiontaítear éilipseacht mhólar ag 222 nm go cion de fhillteacha nádúrtha.e Tástáil inbhéartaithe NTFlSp, NTMiSp agus NTMiSp laghdaithe (100 mg/mL).Barra scála 5 mm.f speictream CD de NT, NTFlSp, NTMiSp agus NTMiSp laghdaithe.Tiontaítear éilipseacht mhólar ag 222 nm go cion de fhillteacha nádúrtha.Léirítear speictream iomlán NT ag 25 °C agus 95 °C i bhFíor 8 Forlíontach.
Cinneann tiúchan fiseolaíoch salainn idirghníomhaíochtaí leictreastatacha idir fo-aonaid NT agus maolú ar aistriú NT go pH18 níos ísle.Fuaireamar amach gur chuir láithreacht 154 mM NaCl agus NaF bac ar ghlóthachtáil, faoi seach (Fíor 5a, b; Fíor Fhorlíontach 2b) agus gur mhéadaigh na salainn seo cobhsaíocht theirmeach monaiméirí NT (Fíor 5b, Fíor Fhorlíontach. 8) .Tugann sé le fios freisin go gcuireann feabhsú cobhsaíochta, seachas maolú, cosc ​​​​ar fhoirmiú glóthacha.
Chun iniúchadh breise a dhéanamh ar an ról atá ag maolú próitéine agus cobhsaíocht i geiliú, d'úsáideamar dhá mutants, NT* agus NTA72R, atá fós monaiméireach ag pH íseal 28.30.Is tsóiteáin aisiompaithe lucht dúbailte é NT* ina bhfuil dáileadh lucht dépholach an mhonaiméir cothromaithe, rud a choscann maolú agus a mhéadaíonn cobhsaíocht mhonaiméir go suntasach.Is dépholach luchtaithe é NTA72R, ach tá Ala, a chuirtear in ionad Arg, suite ag an teorainn dimer, agus mar sin cuireann sócháin isteach ar idirghníomhaíochtaí fo-aonaid a theastaíonn le haghaidh maolú.Ar gor ag 37°C, níor fhoirmigh NT* hidrogel, agus chruthaigh NTA72R glóthach teimhneach ar feadh 15 nóiméad (Fíor 5c).Ós rud é nach féidir le NT* agus NTA72R araon maolú ach go bhfuil cobhsaíocht mhonaiméir éagsúil leo (Fíor 5d), tugann na torthaí seo le tuiscint go láidir go gcuireann cobhsaíocht ard teirmidinimice cosc ​​ar NT ó ghlóthach.Tá sé seo tacaithe freisin ag an bhfíric go ndéanann HT* glóthach nuair a bhíonn sé éagobhsaí ag teocht ard (tar éis 8 nóiméad ag 60 °C; Fíor 5c).Taispeánadh roimhe seo go leachtaíonn an t-ábhar ard meitiainín in NT a fhilleadh nádúrtha agus go ndéanann sé ionadaí Met to Leu (dá dtagraítear anseo mar His-NT-L6) an monaiméir NT46 a chobhsú go láidir.Bunaithe ar an toimhde go bhfuil gá le solúbthacht struchtúrach chun glóthach NT a fhoirmiú, fuaireamar amach nach raibh an tsóiteáin chobhsaí His-NT-L6 glóthach ag 37 ° C (Fíor 5c, d).Mar sin féin, foirmíodh His-NT-L6 glóthach freisin ar gor ag 60°C ar feadh 60 nóiméad (Fíor 5c).
Is cosúil go mbaineann cumas NT struchtúir β-bhileog agus hidrigilití a fhoirmiú le roinnt de na fearainn NT de spidroin ach ní i ngach ceann díobh.Chruthaigh NTanna ó chineálacha síoda éagsúla agus speiceas damháin alla, Trichonephila clavipes (NTFlSp), glóthacha in ainneoin a n-ábhar measartha íseal meitiainín agus cobhsaíocht teirmeach ard (Fíor 5e, f agus Tábla Forlíontach 2).I gcodarsnacht leis sin, ní raibh NT ón spidroin próitéin ampullar beag ó Araneus ventricosus (NTMiSp) le cobhsaíocht teirmeach íseal agus ábhar ard meitiainín ina hidrogels (Tábla Forlíontach 2 agus Fíor 5e, f).D’fhéadfadh baint a bheith ag an dara ceann le láithreacht bannaí déshhuilfíde ionmhóilíneach29,47.Go comhsheasmhach, nuair a laghdaíodh na bannaí disulfide de NMiSp, foirmíodh sé hidrogel tar éis gor ag 37 ° C ar feadh 10 nóiméad (Fig. 5e).Mar fhocal scoir, ba chóir a thabhairt faoi deara go bhfuil solúbthacht struchtúrach ina critéar tábhachtach, ach ní hé an t-aon chritéar maidir le glóthach a fhoirmiú ó NT.Fachtóir eile a d'fhéadfadh a bheith ábhartha ná an claonadh chun fibrilí amyloideacha a fhoirmiú, agus léirigh anailís leis an mbunachar sonraí zipper agus an algartam Waltz comhghaol idir an cumas glóthacha a fhoirmiú agus láithreacht na réigiún amyloidogenic, chomh maith le méid na réigiún a thuar. a fhoirmiú zippers steric.Bhí comhghaol ann (Tábla Forlíontach 2 agus Fig. 9 Forlíontach).
Mar gheall ar chumas NT fibrilí a fhoirmiú agus glóthacha a fhoirmiú faoi choinníollacha fabhracha, thugamar hipitéis dúinn gur féidir le comhleánna NT le blúirí próitéine eile glóthacha a fhoirmiú fós le lánfheidhm na gcomhpháirtithe comhleá.Chun é seo a thástáil, thugamar isteach próitéin fluaraiseacha glas (GFP) agus purine nucleoside phosphorylase (PNP) ag C-terminus an NT, faoi seach.Léiríodh na próitéiní comhleá mar thoradh air sin in E. coli le táirgeacht deiridh an-ard (150 mg/L agus 256 mg/L cultúir fhleascáin chroith le haghaidh His-NT-GFP agus His-NT-PNP, faoi seach), ag teacht leis an méid atá léirithe. do phróitéiní eile comhleádh le NT Tag.30. Chruthaigh próitéiní comhleá His-NT-GFP (300mg/mL) agus His-NT-PNP (100mg/mL) glóthacha tar éis 2 uair agus 6.5 uair ag 37°C agus, níos tábhachtaí fós, níor tháinig aon athrú ar an gcodán GFP.breathnaíodh tar éis geiliú, agus >70% den déine fluaraiseachta tosaigh fágtha tar éis geiliú (Fíor 6a).Chun gníomhaíocht PNP a thomhas ina réitigh agus glóthacha-NT-PNP, bhí orainn an próitéin chomhleá a chaolú le NT toisc go raibh gníomhaíocht einsímeach an ullmhúcháin íon lasmuigh de raon braite na measúnachta ag tiúchan glóthaithe.Choinnigh an glóthach a foirmíodh le meascán ina raibh 0.01 mg/mL His-NT-PNP agus 100 mg/ml NT 65% de ghníomhaíocht einsímeach tosaigh na samplaí réamh-ghoirte (Fíor 6b).D'fhan an glóthach slán le linn an tomhais (Fíor Forlíontach 10).
déine fhluaraiseachta choibhneasta roimh agus tar éis geiliú His-NT-GFP (300 mg/mL) agus vial inbhéartaithe ina bhfuil hidreagall His-NT-GFP (300 mg/ml) faoi sholas infheicthe agus UV.Léiríonn pointí tomhais aonair (n = 3), léiríonn barraí earráide an diall caighdeánach.Taispeántar an meánluach i lár na mbarraí earráide.b Fuarthas gníomhaíocht PNP trí anailís fhluairiméadrach ag baint úsáide as tuaslagáin agus glóthacha comhdhéanta de NT (100 mg/ml) agus meascán ina raibh 0.01 mg/ml his-NT-PNP agus 100 mg/ml dollar Nua Taiwan.Taispeánann an inset vial inbhéartaithe ina bhfuil hidrogel ina bhfuil His-NT-PNP (barra scála 5 mm).
Anseo, tuairiscímid foirmiú hidrogels ó NT agus ó phróitéiní spidroin in-athchuingreach eile trí thuaslagán próitéine a chothú ag 37°C (Fíor 1).Léirímid go bhfuil baint ag geiliú le claochlú α-helices i β-sraitheanna agus foirmiú fibrilí amyloid-mhaith (Figs. 3 agus 4).Is ábhar iontais é an toradh seo mar gur cuachtaí cruinneogacha cúig héilics coiled iad NTanna a bhfuil aithne orthu as a dtuaslagthacht thar a bheith ard agus cobhsaíocht ard ag tiúchan >200 mg/mL ag 4°C le roinnt laethanta27.Ina theannta sin, is furasta NTanna a athfhilleadh tar éis dínádúrú teasa ag tiúchan íseal próitéine i µM.De réir ár dtorthaí, éilíonn foirmiú fibril meascán de > 10 mg/ml de thiúchan próitéine agus teocht beagán ardaithe (Fíor 1).Tá sé seo comhsheasmhach leis an smaoineamh gur féidir fibrilí amyloid a fhoirmiú ó phróitéiní atá fillte go cruinne agus atá i riocht neamhfhillte go páirteach mar gheall ar luaineachtaí teirmeacha faoi choinníollacha fiseolaíocha 48 .I measc na samplaí de phróitéiní a théann faoin tiontú seo tá inslin49,50, β2-micreaglobulin, trasthyretin agus lísisím51,52,53.Cé gur α-helix é NT ina stát dúchais, tá thart ar 65% den slabhra polaipeiptíde ag luí le foirmiú zipper steric (Fíor 4e) 45 .Ós rud é go bhfuil an monaiméir soghluaiste go dinimiciúil46, is féidir leis na réigiúin amyloidogenic ionchasacha seo a nochtadh ag teochtaí measartha ardaithe agus ag tiúchan arda próitéine iomlán is féidir leis tiúchan ríthábhachtach a bhaint amach maidir le foirmiú fibril amyloid54.Tar éis na réasúnaíochta seo, fuaireamar comhghaol diúltach idir tiúchan spidroin agus am geilithe (Fíor 1c), agus má dhéantar an comhfhoirmiú monaiméireach NT a chobhsú trí shócháin (NT*, His-NT-L6) nó trí bhreis salainn, féadann sé an comhghaolú a chosc. hidrogels foirmiú (Fig. 5).
I bhformhór na gcásanna, imíonn fibrilí amyloid ó thuaslagán mar deascán, ach faoi choinníollacha áirithe is féidir leo hidrogels55,56,57 a fhoirmiú.Is gnách go mbíonn cóimheas ard treoíochta ag fibrilí a fhoirmíonn hidrigil agus cruthaíonn siad gréasáin chobhsaí tríthoiseacha trí cheangal móilíneach,55,58 i gcomhréir lenár dtorthaí.Maidir le foirmiú hidrogel in vitro, is minic nach ndéantar próitéiní a fhilleadh go hiomlán nó go páirteach, mar shampla, trí nochtadh do thuaslagóirí orgánacha, teocht ard (70–90°C) agus/nó pH íseal (1.5–3.0)59,60,61,62.Ní bhíonn próiseáil dhian ag teastáil ó na hidrogels spidroin a gcuirtear síos orthu anseo, agus ní éilíonn siad gníomhairí tras-nasctha chun na hidrigilití a chobhsú.
Tuairiscíodh roimhe seo go n-athráíonn spidroin agus QDs, a bhfuil an chuma orthu go n-athraítear β-bhileog le linn sníomh síoda, foirmíonn hidrogels.I gcomparáid lenár dtorthaí, bhí amanna goir agus/nó teochtaí gor i bhfad níos faide nó níos airde, faoi seach, agus ba mhinic na hidrigilití mar thoradh orthu teimhneach (Fíor 7 agus Tábla Forlíontach 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Chomh maith le hamanna glóthacha tapa, d'éirigh níos fearr le hidrigéilí NT > 300 mg/mL (30%) ná na hidreacailí próitéine síoda damhán alla athchuingreach eile a ndearnadh cur síos orthu, chomh maith le hidreagain nádúrtha cosúil le geilitín, ailgináit (2%), agar (0.5 % ) agus collaigine.(0.6%) (Fíor 7 agus Táblaí Forlíontacha 1 agus 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Rinneadh comparáid idir an t-am glóthach agus modal leaisteacha na hidrigéil sa staidéar seo le hidrigiltí eile atá bunaithe ar spidroin agus hidrigéil nádúrtha roghnaithe.Tugtar tagairtí chomh maith le cur síos ar na coinníollacha glóthacha.APS Persulfate amóiniam, teocht an tseomra.Sonraí 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Is cosúil go bhfuil bealaí forbartha ag damháin alla chun cosc ​​​​a chur ar spidroin ó gelling le linn stórála.In ainneoin an tiúchan ard próitéine sa fhaireog síoda, ciallaíonn an réigiún athrá mór a bhaineann leis an bhfearann ​​​​teirminéal go gcomhfhreagraíonn an tiúchan dealraitheach de NT agus CT sa fhaireog do thart ar 10-20 mg / ml, ag teorainn an staidéir seo.ag teastáil le haghaidh foirmiú hidrogel breathnaithe in vitro.Ina theannta sin, chobhsaigh tiúchan den chineál céanna salainn 16 NT, mar atá i faireoga síoda (Fíor 5b).Tá staidéar déanta ar chomhfhoirmiú NT sa chitosól E. coli agus fuarthas amach go raibh sé fillte níos dlúithe ná nuair a scrúdaíodh é in vitro, rud a thugann le fios tuilleadh go gcuireann salann nó fachtóirí eile cosc ​​​​ar a chomhiomlánú in vivo.Mar sin féin, d'fhéadfadh cumas NTanna a chlaochlú go fibrilí β-bhileog a bheith tábhachtach maidir le foirmiú filiméid agus ba cheart é a imscrúdú i staidéir amach anseo.
Chomh maith leis na gnéithe nua a bhaineann le foirmiú fibril agus hidrogel NT-amyloid-mhaith a breathnaíodh sa staidéar seo, léirímid freisin go bhféadfadh feidhmeanna biteicneolaíocha agus bithleighis a bheith ag an bhfeiniméan seo (Fíor 8).Mar chruthúnas ar choincheap, chomhcheangail muid NT le GFP nó PNP agus thaispeáin muid go gcruthaíonn an próitéin comhleá hidreacailí freisin nuair a gortar iad ag 37 ° C agus go gcoimeádann na codáin GFP agus PNP a ngníomhaíocht tar éis geiliú den chuid is mó (Fíor 6).Is catalaíoch tábhachtach iad fosfarylaisí núicléasaigh do shintéisiú analógacha núicléaside75, rud a fhágann go bhfuil ár bhfionnachtain ábhartha don tionscal bithchógaisíochta.Leis an gcoincheap a bhaineann le próitéiní comhleá a chur in iúl a fhoirmíonn hidrogels trédhearcacha faoi choinníollacha fabhracha, ceadaítear hidrigéilí feidhmiúla a chruthú a bhfuil airíonna fabhracha acu le haghaidh raon leathan feidhmchlár amhail díluailithe einsímí, scaoileadh drugaí rialaithe agus innealtóireacht fíocháin.Ina theannta sin, is marcóirí éifeachtacha slonn iad NT agus NT*30, rud a chiallaíonn gur féidir NT agus a leaganacha a úsáid le haghaidh táirgeadh ard-thréchur de chomhleá próitéiní intuaslagtha agus cruthú spriocphróitéiní díluailithe i hidrigéil 3D ina dhiaidh sin.
Tá NT intuaslagtha, α-helical agus cobhsaí ag tiúchan íseal (µM) agus 37°C.Ag an teocht chéanna, ach ag comhchruinnithe méadaithe (> 10 mg/ml), foirmíonn NT glóthacha ina bhfuil fibrilí amyloid-mhaith.Cruthaíonn próitéiní comhleá NT glóthacha fibrilleacha freisin le blúirí comhleá lánfheidhme, rud a ligeann do phróitéiní éagsúla a dhíluailithe i hidrigéil 3D ag baint úsáide as NT.Bun: NT (PDB: 4FBS) agus léaráidí de líonraí snáithíní agus struchtúir ghaolmhara próitéine (toimhdithe agus gan a bheith tarraingthe de réir scála, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2).
Rinneadh na constructs (féach Tábla Forlíontach 4 le haghaidh liosta iomlán lena n-áirítear seichimh aimínaigéad) a chlónáil isteach i plasmid pT7 agus a chlaochlú go E. coli BL21 (DE3).Ionaclaithe E. coli ina raibh plasmids innealtóireacht i brat Luria forlíonta le kanamycin (70 mg/l) agus fásadh thar oíche ag 30 ° C agus 250 rpm.Rinneadh an cultúr a ionaclú ansin 1/100 i meán LB ina raibh kanamycin agus saothraíodh é ag 30 ° C agus 110 rpm go dtí gur shroich an OD600 0.8.I gcás staidéir NMR, fásadh baictéir i meánmhéid íosta M9 ina raibh 2 g de D-glúcóis 13C (Aldrich) agus 1 g de chlóiríd amóiniam 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) le haghaidh lipéadú próitéine le iseatóip.Ísligh an teocht go 20 céim Celsius agus spreag léiriú próitéine le 0.15 mM isopropilthiogalactopyranoside (tiúchan deiridh).Tar éis léiriú próitéine thar oíche, baineadh cealla ag 7278 × g, 4 ° C ar feadh 20 nóiméad.Athchóiríodh millíní cille i 20 mM Tris-HCl, pH 8, agus reoite go dtí go n-úsáidfí a thuilleadh iad.Cuireadh cealla leáite ag baint úsáide as réabóir cille (meaisíní sraith TS, Constant Systems Limited, Sasana) ag 30 kPa.Ansin lártheifneoiríodh na lysates ag 25,000 g ar feadh 30 nóiméad ag 4°C.Maidir le NTMiSp, athchuireadh an millíní ansin i 2 M úiré, 20 mM Tris-HCl, pH 8, agus sonicated ar feadh 2 nóiméad (2 s ar / as, 65%), ansin lártheifneoiriú arís ag 25,000 xg, 4 ° C. laistigh de. 30 nóim.Lódáltar an súthach ar cholún Ni-NTA, nite le 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazole, pH 8, agus ar deireadh, bhí an próitéin eluted le 20 mM Tris-HCl, imidazole 200 mM, pH 8. Chun NT2RepCT a ghiniúint agus NTCT, tugann díleá thrombin isteach an suíomh (ThrCleav) idir His agus NT.Tá suíomhanna scoilteachta thrombin i láthair freisin i His-NT-ThrCleav-2Rep (táirgeann 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (táirgeann NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (táirgeann CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (táirgeann NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (táirgeann NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (táirgeann NTF1Sp), agus His-Sulfair Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (táirgeann NTMIP).Díleádh na tógálacha le thrombin (1:1000) agus scagdhealaíodh iad thar oíche ag 4° C. le 20 mM Tris-HCl, pH 8, ag baint úsáide as membrane scagdhealaithe Spectra/Por le tairseach meáchan móilíneach de 6-8 kDa.Tar éis scagdhealaithe, luchtaítear an tuaslagán ar cholún Ni-NTA agus bailítear an t-eisilteach ina bhfuil an próitéin inspéise.Cinneadh tiúchan próitéine trí ionsú UV a thomhas ag 280 nm ag baint úsáide as comhéifeacht díothaithe gach próitéine, ach amháin NTF1Sp, a d'úsáid measúnacht Bradford de réir phrótacal an mhonaróra.Socraíodh íonacht ag polyacrylamide SDS (4-20%) leictreafóiréis glóthach agus Coomassie staining gorm iontach.Díríodh próitéiní ag baint úsáide as scagairí lártheifneora (VivaSpin 20, GE Healthcare) ag 4000 xg le gearradh siar meáchain mhóilíneach 10 kDa i dtimthriallta 20 nóiméad.
Leáigh an tuaslagán próitéine agus go cúramach píp 150 µl isteach i vial septum soiléir 1 ml (8 x 40 mm Thermo Scientific).Cuireadh caipín ar na feadáin agus séalaithe le parascannán chun galú a chosc.Goradh samplaí (n = 3) ag 37°C nó 60°C agus go tréimhsiúil iad a inbhéartú chun geiliú a bhreathnú.Goradh samplaí nach raibh glóthach orthu ar feadh seachtaine amháin ar a laghad.Laghdaigh bannaí déshulfíde NTMiSp le 10 mM DTT in aghaidh an phróitéin 10 µM.Chun anailís a dhéanamh ar fhoirmiú bratuithe síoda spider nádúrtha, gearradh an damhán alla droichead Sualainne, cuireadh an dá phríomh-fhaireog aimplithe i 200 μl de 20 mM Tris-HCl maolán pH 8 agus gearrtha chun ligean don sciath scaradh ó na faireoga..Déantar inneachar na faireoga a thuaslagadh i maolán, 50 µl chun meáchan tirim a chinneadh (trí vials oscailte a ghoradh ag 60 °C go dtí an meáchan tairiseach) agus 150 µl le haghaidh glóthaithe ag 37 °C.
Tá an geoiméadracht / uirlis tomhais déanta as cruach dhosmálta ag baint úsáide as pláta comhthreomhar le trastomhas barr 20 mm agus bearna de 0.5 mm.Déan an sampla a théamh ó 25 °C go 45 °C agus ar ais go 25 °C ag ráta 1 °C in aghaidh an nóiméid ag baint úsáide as pláta Peltier bun cruach dhosmálta.Rinneadh tomhais chreathadh ag minicíocht 0.1 Hz agus i réigiún líneach viscoelastic an ábhair ag brú 5% agus 0.5% le haghaidh samplaí 100 mg/mL agus 300–500 mg/mL, faoi seach.Bain úsáid as seomra taise saincheaptha chun galú a chosc.Rinneadh anailís ar na sonraí trí úsáid a bhaint as Prism 9.
Chun speictream infridhearg (IR) a bhailiú ag teocht an tseomra ó 800 go 3900 cm–1.Glantar an gléas ATR, chomh maith leis an gcosán solais tríd an speictriméadar, le haer tirim scagtha roimh an turgnamh agus lena linn.Pípéadaíodh réitigh (500 mg/ml chun buaiceanna ionsú uisce sa speictream) a íoslaghdú ar na criostail, agus foirmíodh glóthacha (500 mg/ml) roimh an tomhas agus ansin aistríodh iad chuig na criostail (n = 3).Taifeadadh 1000 scanadh le taifeach 2 cm-1 agus timthriall dleachta nialasach de 2. Ríomhadh an dara díorthach ag baint úsáide as OPUS (Bruker) ag baint úsáide as raon smúdála de naoi bpointe.Rinneadh na speictrim a normalú go dtí an réigiún comhtháthaithe céanna idir 1720 agus 1580 cm-1 ag baint úsáide as F. Menges “Spectragryph – Optical Spectroscopy Software”.I speictreascópacht ATR-IR, tá doimhneacht treá léasa infridhearg isteach i sampla ag brath ar thonnuimhreacha, rud a fhágann go bhfuil ionsú níos láidre ag tonnuimhreacha níos ísle ná ag uimhreacha tonn níos airde.Níl na héifeachtaí seo ceartaithe don speictream a thaispeántar i bhFíoracha.3 toisc go bhfuil siad an-bheag (Fig. Forlíontach 4).Ríomhadh speictream ceartaithe don fhigiúr seo trí úsáid a bhaint as bogearraí Bruker OPUS.
I bprionsabal, is féidir cainníochtú cuimsitheach comhréireachta próitéine tar éis dí-chomhbhrú iontaofa na gcomhpháirteanna laistigh den bhuaic amide I.Mar sin féin, tagann roinnt constaicí chun cinn go praiticiúil.Is féidir le torann sa speictream a bheith le feiceáil mar bhuaiceanna (bréagacha) le linn an dí-chonóilithe.Ina theannta sin, tá an buaic mar gheall ar lúbadh uisce ag an am céanna le seasamh an bhuaic amide I agus d'fhéadfadh méid comhchosúil a bheith aige le haghaidh samplaí ina bhfuil méid mór uisce, mar an glóthach uiscí a ndéantar staidéar air anseo.Mar sin, ní dhearnamar iarracht an bhuaic aimíde I a dhianscaoileadh go hiomlán, agus níor cheart ár dtuairimí a mheas ach amháin chun tacú le modhanna eile ar nós speictreascópacht NMR.
Gealladh tuaslagáin de 50 mg/ml NT agus His-NT2RepCT thar oíche ag 37°C.Caolaíodh an hidrogel ansin le 20 mM Tris-HCl (pH 8) go dtí tiúchan 12.5 mg/ml, croith go maith é agus píobánaíodh é chun an glóthach a bhriseadh.Ansin, caolaíodh an hidrogel 10 n-uaire le 20 mM Tris-HCl (pH 8), cuireadh 5 μl den sampla i bhfeidhm ar ghreille copair atá brataithe le formvar, agus baineadh an sampla breise le páipéar blotting.Nigh na samplaí faoi dhó le 5 µl d'uisce MilliQ agus dathaíodh iad le formáid úráinil 1% ar feadh 5 nóiméad.Bain an stain iomarcach le páipéar ionsúiteach, ansin aer tirim an mogalra.Rinneadh íomháú ar na heangacha seo agus úsáid á baint as FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN ag oibriú ar 100 kV.Taifeadadh na híomhánna ag x 26,500 agus x 43,000 méadaithe ag baint úsáide as ceamara CCD Veleta 2k × 2k (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, an Ghearmáin).I gcás gach sampla (n = 1), taifeadadh 10-15 íomhá.Baineadh úsáid as ImageJ (https://imagej.nih.gov/) le haghaidh anailíse íomhá agus tomhas trastomhais snáithíní (n = 100, snáithíní éagsúla).Baineadh úsáid as Prism 9 chun t-tástálacha neamhphéireáilte (dhá eireaball) a dhéanamh.Ba iad na fibrilí meánacha His-NT2RepCT agus NT ná 11.43 (SD 2.035) agus 7.67 (SD 1.389) nm, faoi seach.Is é an t-eatramh muiníne (95%) ná -4.246 go -3.275.céimeanna saoirse = 198, p < 0.0001.
Rinneadh 80 µl de shamplaí leachtacha ina raibh 10 µM thioflaivin T (ThT) a thomhas i dtrí chóip (n = 3) faoi choinníollacha statacha ag baint úsáide as plátaí bun soiléir bun dubh Corning 96-tobar (Corning Glass 3881, SAM).Taifeadadh difríochtaí fluaraiseachta ag baint úsáide as scagaire excitation 440 nm agus scagaire astaíochta 480 nm (FLUOStar Galaxy ó BMG Labtech, Offenburg, an Ghearmáin).Ní raibh an comhartha ThT sáithithe ná múchta, toisc go ndearnadh turgnaimh le tiúchain éagsúla ThT gan déine an chomhartha a athrú.Taifead ionsúiteacht ag 360 nm le haghaidh Clear a thomhas.Le haghaidh turgnaimh síolaithe, foirmíodh glóthacha 100 mg / ml ag 37 ° C., athfhionraí, agus úsáideadh iad le haghaidh síolú ag cóimheasa molar de 5%, 10%, agus 20%.Rinneadh anailís ar na sonraí trí úsáid a bhaint as Prism 9.
Leáigh stoic His-NT2RepCT agus NT >100 mg/mL ar oighear agus scag trí scagaire 0.22 µm.Ríomhadh comhchruinnithe trí ionsúchán a thomhas ag 280 nm ag baint úsáide as Nanodrop.I toibreacha de phláta neamhcheangailteach dubh 96-tobar (Corning) le bun soiléir, caolaíodh samplaí go 20 mg/ml i 20 mM Tris-HCl pH 8 agus measctha le 5 μM ThT (tiúchan deiridh), tiúchan iomlán an tsampla. 50 μl toirte.Rinneadh samplaí a íomháú gach 10 nóiméad ag 37 °C ar mhicreascóp CellObserver (Zeiss) le cainéal solais tarchurtha agus tacair scagairí sceite agus astaithe FITC le haghaidh íomháithe ThT.Úsáidtear lionsa 20x/0.4 le haghaidh íomháithe.Baineadh úsáid as Zen Blue (Zeiss) agus ImageJ (https://imagej.nih.gov/) le haghaidh anailíse íomhá.Ullmhaíodh glóthacha freisin ó réitigh NT agus His-NT2RepCT ag tiúchan 50 mg/mL ina raibh 20 mM Tris pH 8 agus 5 µM ThT agus gortha ag 37°C ar feadh 90 nóiméad.Aistríodh na píosaí glóthacha chuig tobar nua ina raibh 20 mM Tris, pH 8, agus 5 μM ThT i pláta bun soiléir dubh neamhcheangailteach 96.Faigh fluaraiseacht glas agus íomhánna réimse geala ag formhéadú 20x/0.4.Baineadh úsáid as ImageJ le haghaidh anailíse íomhá.
Réiteach Fuarthas speictrim NMR ag 310 K ar speictriméadar Bruker Avance Neo 600 MHz atá feistithe le Crióprób Réimse Grádán Athshondais Pulsáilte Quadrupole QCI (HFCN).Samplaí NMR ina bhfuil próitéin aonchineálach 10 mg/mL lipéadaithe le 13C, 15N, tuaslagtha i 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Baineadh úsáid as aistrithe ceimiceacha NT2RepCT ag pH 6.7 chun buaic 23 a shannadh sa speictream 2D ​​de 15N-HSQC.
Taifeadadh speictream NMR soladach sníomh draíochtúil NMR (MAS) de 13C, hidrigéil lipéadaithe 15N ar speictriméadar Bruker Avance III HD ag 800 MHz feistithe le taiscéalaí gan leictreon 3.2 mm 13C/15N{1H}.Rinneadh teocht an tsampla a rialú ag baint úsáide as sruth gáis teochta athraitheach ag 277 K. Fuarthas speictrim athshondas rothlach dépholach déthoiseach (DARR)76 agus athnascadh minicíochta raidió (RFDR)77 ag minicíochtaí MAS de 12.5 kHz agus 20 kHz, faoi seach.Rinneadh traspholarú (CP) ó 1H go 13C ag baint úsáide as rampa líneach ó 60.0 go 48.0 kHz ag 1H, 61.3/71.6 kHz ag 13C (ag 12.5/20 kHz MAS) agus am teagmhála 0.5–1 ms.Baineadh úsáid as díchúpláil spinal6478 ag 73.5 kHz le linn bailiú sonraí.Ba é 10 milleasoicind an t-am fála agus ba é 2.5 soicind an mhoill timthrialla.Sannadh na comhghaolta Cα/Cβ aon-nasctha a breathnaíodh sa speictrim RFDR bunaithe ar na haistrithe ceimiceacha de chineál iarmhar sainiúil agus ar chomhghaolta iolraithe sa speictrim DARR.
Baineadh úsáid as bunachar sonraí Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) chun claonadh flutter agus fuinneamh Rosetta a mheas le haghaidh NT, NTFlSp, agus NTMiSp.Ríomhtar Rosetta Energy80 sa bhunachar sonraí Zipper, a chomhcheanglaíonn roinnt feidhmeanna fuinnimh saor in aisce chun struchtúr próitéin a shamhaltú agus a anailísiú.Léiríonn leibhéal fuinnimh de -23 kcal/mol nó níos ísle claonadh ard chun fibrillate.Ciallaíonn an fuinneamh níos ísle cobhsaíocht níos mó den dá β-snáithe sa chomhfhoirmiú zipper.Ina theannta sin, baineadh úsáid as an algartam Waltz chun réigiúin amyloidogenic a thuar in NT, NTFlSp agus NTMiSp Ref.81. ( https://waltz.switchlab.org/ ).
Meascadh an tuaslagán próitéin NT le maolán aigéad 2-(N-morpholino) ethanesulfónach (MES) ag pH 5.5 agus 6.0 chun an pH a ísliú go pH 6 agus 7, faoi seach.Ba é an tiúchan próitéine deiridh ná 100 mg/ml.
Rinneadh tomhais ar speictriméadar J-1500 CD (JASCO, SAM) ag baint úsáide as cuvette 300 μL le cosán optúil 0.1 cm.Caolaíodh próitéiní go 10 μM (n = 1) i maolán fosfáit 20 mM (pH 8).Chun anailís a dhéanamh ar chobhsaíocht próitéine i láthair salainn, rinneadh anailís ar phróitéiní ag an tiúchan céanna (n = 1) i maolán fosfáit 20 mM (pH 8) ina raibh 154 mM NaF nó NaCl, faoi seach.Taifeadadh scananna teochta ag 222 nm ó 25°C go 95°C le ráta téimh 1°C/nóiméad.Ríomhadh comhréir na bpróitéiní fillte dúchais ag baint úsáide as an bhfoirmle (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Ina theannta sin, taifeadadh cúig speictream do gach sampla ó 260 nm go 190 nm ag 25°C agus tar éis téimh go 95°C.Rinneadh cúig speictream a mheán, a mhaolú agus a thiontú go héilipseacht molar.Rinneadh anailís ar na sonraí trí úsáid a bhaint as Prism 9.
Rinneadh déine fluaraiseachta His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) a thomhas i dtrí chóip (n = 3) i bplátaí Corning 96-tobar le bun dubh trédhearcach (Corning Glass 3881, SAM) faoi choinníollacha statacha.Tomhais samplaí le léitheoir pláta fluaraiseachta-bhunaithe le tonnfhad excitation de 395 nm agus taifead an t-astú ag 509 nm roimh geiliú agus 2 uair níos déanaí ag 37°C.Rinneadh anailís ar na sonraí le Prism 9.
Baineadh úsáid as trealamh measúnaithe gníomhaíochta phosphorylase purine nucleoside (modh fluairiméadrach, Sigma Aldrich) de réir threoracha an mhonaróra.Chun gníomhaíocht glóthacha agus tuaslagáin ina bhfuil His-NT-PNP a thomhas, measc 10 ng de His-NT-PNP le 100 mg/mL NT go dtí toirt iomlán 2 µL toisc gur thug an glóthach comhartha os cionn eatramh braite an tacair.Áiríodh rialuithe le haghaidh glóthacha agus réitigh gan His-NT-PNP.Rinneadh na tomhais faoi dhó (n = 2).Tar éis an ghníomhaíocht a thomhas, baineadh an meascán imoibrithe agus tógadh grianghraf den fhoirmiú chun a chinntiú go bhfanfadh an glóthach slán le linn an tomhais.Rinneadh anailís ar na sonraí trí úsáid a bhaint as Prism 9.
Chun tuilleadh eolais a fháil ar dhearadh an staidéir, féach an coimriú ar an staidéar Dúlra atá nasctha leis an alt seo.
Léiríonn Fíor 1 agus 2 na sonraí tosaigh.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, agus 6, Fíoracha Forlíontacha.3, fig forlíontach.5a, d, fig forlíontach.6 agus fig forlíontach.8. Sonraí Tá sonraí ón staidéar seo á óstáil i mbunachar sonraí Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Postáladh na sonraí NMR a fuarthas sa staidéar seo chuig an stór BMRBig faoin ID iontrála bmrbig36.Tógadh struchtúir GFP agus PNP ó PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Éirí Amach, A. agus Johansson, J. Ag casadh síoda damháin alla saorga.Ceimiceach Náisiúnta.bitheolaíocht.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.Leagann an genome Nephila clavipes béim ar éagsúlacht na ngéinte síoda damháin alla agus a léiriú casta.Genette Náisiúnta.49, 895–903 (2017).