304 comhábhar ceimiceach feadánra corna cruach dhosmálta, Tá superteaghlach caomhnaithe de phróitéiní a bhaineann le comhleá gaiméit i struchtúr an ectodomain SPACA6.

Go raibh maith agat as cuairt a thabhairt ar Nature.com.Tá tú ag baint úsáide as leagan brabhsálaí a bhfuil tacaíocht CSS teoranta aige.Chun an taithí is fearr a fháil, molaimid duit brabhsálaí nuashonraithe a úsáid (nó Mód Comhoiriúnachta a dhíchumasú in Internet Explorer).Ina theannta sin, chun tacaíocht leanúnach a chinntiú, taispeánann muid an suíomh gan stíleanna agus JavaScript.
Sleamhnáin a thaispeánann trí alt in aghaidh an tsleamhnáin.Bain úsáid as na cnaipí cúil agus seo chugainn chun bogadh tríd na sleamhnáin, nó na cnaipí rialtóra sleamhnáin ag an deireadh chun bogadh trí gach sleamhnán.

Is próitéin dromchla sperm-léirithe é SPACA6 atá ríthábhachtach le haghaidh comhleá gaiméití le linn atáirgeadh gnéasach mamaigh.In ainneoin an róil bhunúsach seo, is beag an tuiscint atá ar shainfheidhm SPACA6.Déanaimid soiléiriú ar struchtúr criostail an fhearainn eischeallach de SPACA6 ag taifeach 2.2 Å, ag nochtadh próitéin dhá-fhearann ​​atá comhdhéanta de bheart ceithre shnáithe agus ceapairí β cosúil le Ig ceangailte le nascóirí leath-solúbtha.Tá an struchtúr seo cosúil le IZUMO1, próitéin eile a bhaineann le comhleá gaiméite, rud a fhágann gur baill bhunaidh SPACA6 agus IZUMO1 den supertheaghlach de phróitéiní a bhaineann le toirchiú dá dtagraítear anseo mar an superfamily IST.Tá sainmhíniú struchtúrach ar shártheaghlach IST ag a bheart casta ceithre héilics agus péire móitífeanna CXXC atá nasctha le déshilfíd.D'aithin cuardach struchtúr-bhunaithe AlphaFold ar an bpróitéama daonna baill bhreise próitéine den supertheaghlach seo;go háirithe, tá baint ag go leor de na próitéiní seo le comhleá gaiméití.Soláthraíonn struchtúr SPACA6 agus an gaol atá aige le baill eile den supertheaghlach IST an nasc atá in easnamh inár n-eolas ar chomhleá gaiméití mamaigh.
Tosaíonn gach saol daonna le dhá gaiméit haploid ar leith: sperm an athar agus ubh na máthar.Buaiteoir an speirm seo ar dhianphróiseas roghnúcháin ina dtéann na milliúin cealla speirm tríd an gconair ghiniúna baineann, a sháraíonn constaicí éagsúla1 agus a théann faoi toilleas, rud a fheabhsaíonn a ghluaiseacht agus próiseas na gcomhpháirteanna dromchla2,3,4.Fiú má fhaigheann an speirm agus an úicít a chéile, níl deireadh leis an bpróiseas fós.Tá an t-úicít timpeallaithe ag sraith de chealla cumal agus bacainn glycoprotein ar a dtugtar an zona pellucida, trína gcaithfidh sperm dul isteach san úicít.Úsáideann spermatozoa meascán de mhóilíní greamaitheachta dromchla agus einsímí a bhaineann le membrane agus secreted chun na bacainní deiridh seo a shárú5.Stóráiltear na móilíní agus na heinsímí seo go príomha sa scannán inmheánach agus sa mhaitrís acrosomal agus aimsítear iad nuair a dhéantar membrane seachtrach an speirm a líseáil le linn an imoibrithe acrosomal6.Is í an chéim dheireanach sa dian-aistear seo ná an teagmhas comhleá ubh-speirm, ina ndéanann an dá chill a gcuid seicní a chomhleá le bheith ina n-orgánach dioplóideach amháin7.Cé go bhfuil an próiseas seo ceannródaíoch san atáirgeadh daonna, ní thuigtear go dona na hidirghníomhaíochtaí móilíneacha is gá.
Chomh maith le toirchiú gaiméití, tá staidéar fairsing déanta ar cheimic chomhleá dhá dhéshraith lipid.Go ginearálta, is próiseas fuinniúil neamhfhabhrach é comhleá membrane a éilíonn ar chatalaíoch próitéin dul faoi athrú struchtúir struchtúrach a thugann dhá membrane níos gaire dá chéile, ag briseadh a leanúnachas agus ag cruthú comhleá8,9.Fusogens a thugtar ar na catalaíochí próitéine seo agus fuarthas iad i gcórais chomhleá iomadúla.Tá siad ag teastáil chun dul isteach víreasach i gcealla óstaigh (m.sh., gp160 i VEID-1, spíc i gcoróinvíris, hemagglutinin i víris fliú)10,11,12 placental (syncytin)13,14,15 agus comhleá foirmithe gaiméit in eocariotáití ísle ( HAP2/GCS1 i bplandaí, próiteolaithe agus artrapóid) 16,17,18,19.Níl fusogens le haghaidh gaiméití daonna aimsithe fós, cé gur léiríodh go bhfuil roinnt próitéiní ríthábhachtach maidir le ceangal gaiméití agus comhleá.Ba é an CD9 úicítí-léirithe, próitéin trasmembrane a theastaíonn chun luchóg agus gaiméití daonna a chomhleá, an chéad cheann a aimsíodh 21,22,23.Cé go bhfuil a fheidhm bheacht doiléir i gcónaí, is cosúil go bhfuil ról i greamaitheacht, struchtúr na bhfócas greamaitheachta ar mhicrivilli uibheacha, agus/nó logánú ceart próitéiní dromchla úicítí 24,25,26.Is iad an dá phróitéin is tipiciúla atá ríthábhachtach le haghaidh comhleá gaiméití ná an próitéin sperm IZUMO127 agus an próitéin úicítí JUNO28, agus is céim thábhachtach é a gcomhcheangal in aithint gaiméití agus greamaitheacht roimh an gcomhleá.Tá lucha cnagadh fireann Izumo1 agus lucha cnagála mná Juno go hiomlán steiriúil, sna samhlacha seo téann sperm isteach sa spás perivitelline ach ní thagann gaiméití le chéile.Ar an gcaoi chéanna, laghdaíodh an cumar nuair a cuireadh cóireáil le gaiméití le hantasubstaintí frith-IZUMO1 nó JUNO27,29 i dturgnaimh toirchithe in vitro daonna.
Le déanaí, thángthas ar ghrúpa nua-aimsithe de phróitéiní sperm-léirithe atá cosúil go feinitíopach le IZUMO1 agus JUNO20,30,31,32,33,34,35.Aithníodh próitéin acrosomal membrane-ghaolmhar 6 (SPACA6) a bheith riachtanach le haghaidh toirchithe i staidéar mutagenesis murine ar scála mór.Táirgeann ionsá an trasghéine isteach sa ghéin Spaca6 speirmatozoa do-chomh-chomhleáite, cé go n-insíonn na speirmatozoa seo an spás perivitelline 36 .Dhearbhaigh staidéir a rinneadh ina dhiaidh sin ar lucha go bhfuil Spaca6 ag teastáil le haghaidh comhleá gaiméit 30,32 .Sloinntear SPACA6 beagnach go heisiach sna magairlí agus tá patrún logánaithe cosúil leis an gceann atá ag IZUMO1, is é sin laistigh d’intime an speirmatozoa roimh an imoibriú acrosomal, agus ansin aistríonn sé go dtí an réigiún meánchiorcal tar éis an imoibrithe acrosomal 30,32.Tá homalóga Spaca6 ann i mamaigh éagsúla agus eocáirtí eile 30 agus tá a thábhachtaí don chomhleá gaiméití daonna léirithe trí chosc ar thoirchiú daonna in vitro trí fhrithsheasmhacht in aghaidh SPACA6 30 .Murab ionann agus IZUMO1 agus JUNO, níl mionsonraí struchtúr, idirghníomhaíochtaí agus feidhm SPACA6 soiléir fós.
Chun tuiscint níos fearr a fháil ar an bpróiseas bunúsach atá mar bhunús le comhleá speirm daonna agus uibheacha, a chuirfidh ar ár gcumas eolas a chur ar fhorbairtí amach anseo i bpleanáil teaghlaigh agus i gcóireáil torthúlachta, rinneamar staidéir struchtúracha agus bithcheimiceacha SPACA6.Léiríonn struchtúr criostail an fhearainn extracellular de SPACA6 bundle ceithre-helical (4HB) agus fearann ​​​​cosúil le immunoglobulin (cosúil le Ig) ceangailte ag réigiúin leath-solúbtha.Mar a tuaradh i staidéir roimhe seo, 7,32,37 tá struchtúr fearainn SPACA6 cosúil leis an struchtúr IZUMO1 daonna, agus tá móitíf neamhghnách ag an dá phróitéin: 4HB le dromchla héileach triantánach agus péire móitífeanna CXXC atá nasctha le disulfíde.Molaimid go ndéanfadh IZUMO1 agus SPACA6 sainiú anois ar shártheaghlach próitéiní níos mó a bhaineann le comhleá gaiméití a bhfuil baint acu le struchtúr.Ag baint úsáide as gnéithe atá uathúil don sártheaghlach, rinneamar cuardach uileghabhálach ar phróitéam struchtúrach daonna AlphaFold, ag aithint baill bhreise den supertheaghlach seo, lena n-áirítear roinnt ball a bhfuil baint acu le comhleá gaiméití agus/nó toirchiú.Dealraíonn sé anois go bhfuil fillte struchtúrach coiteann agus superteaghlach próitéiní a bhaineann le comhleá gaiméití, agus soláthraíonn ár struchtúr léarscáil mhóilíneach den ghné thábhachtach seo den mheicníocht comhleá gaiméití daonna.
Is próitéin trasmembrane aon-pas é SPACA6 le glycan amháin atá nasctha le N agus sé nasc déshulfíde toimhde (Fíoracha S1a agus S2).Léirigh muid an bhfearann ​​​​extracellular daonna SPACA6 (iarmhair 27-246) i Drosophila cealla S2 agus íonaithe an próitéin ag baint úsáide as cleamhnas nicil, malartú iarratas, agus crómatagrafaíocht eisiamh méid (Fig. S1b).Tá an ectodomain SPACA6 íonaithe an-chobhsaí agus aonchineálach.Léirigh anailís ag baint úsáide as crómatagrafaíocht eisiamh méide in éineacht le scaipthe solais polagánach (SEC-MALS) buaic amháin le meáchan móilíneach ríofa de 26.2 ± 0.5 kDa ( Fíor. S1c).Tá sé seo comhsheasmhach le méid an ectodomain monaiméir SPACA6, rud a léiríonn nach raibh oligomerization le linn íonú.Ina theannta sin, nocht speictreascópacht dichroism ciorclach (CD) struchtúr measctha α/β le leáphointe 51.3 °C (Fíor S1d,e).Nochtadh deconvolution an speictrim CD 38.6% α-helical agus 15.8% β-snáithe eilimintí (Fíor S1d).
Criostalaíodh an ectodomain SPACA6 ag baint úsáide as síolú maitrís randamach38 a d'eascair tacar sonraí le taifeach 2.2 Å (Tábla 1 agus Fíor S3).Ag baint úsáide as teaglaim de ionadú móilíneach blúirí-bhunaithe agus sonraí céimnithe SAD le nochtadh bróimíd chun struchtúir a chinneadh (Tábla 1 agus Fíor S4), is éard atá sa tsamhail scagtha deiridh ná iarmhair 27–246.Ag an am a socraíodh an struchtúr, ní raibh aon struchtúir thurgnamhach nó AlphaFold ar fáil.Tomhaiseann ectodomain SPACA6 20 Å × 20 Å × 85 Å, comhdhéanta de sheacht helices agus naoi β-shnáithe, agus tá fillte treasach fadaithe cobhsaithe ag sé bannaí déshulfíde (Fíor 1a, b).Léiríonn an dlús leictreon lag ag deireadh an tslabhra Asn243 gur glycosylation N-nasctha é an t-iarmhar seo.Tá dhá réimse sa struchtúr: beart N-críochfort ceithre héilics (4HB) agus fearann ​​C-críochfort cosúil le Ig le réigiún hinge idirmheánach eatarthu (Fíor 1c).
a Struchtúr an fhearainn eischeallacha de SPACA6.Léaráid stráice d'fhearann ​​eischeallach SPACA6, dath an tslabhra ó Thuaidh go C-críochfort ó ghorm dorcha go dearg dorcha.Aibhsítear cistéiní a bhfuil baint acu le bannaí disulfide i magenta.b Topology an fhearainn eischeallacha de SPACA6.Bain úsáid as an scéim dathanna céanna agus atá i bhFíor 1a.c SPACA6 fearann ​​eischeallach.Tá na cairteacha stiallacha fearainn 4HB, hinge, agus Ig-mhaith daite oráiste, glas agus gorm, faoi seach.Níl na sraitheanna tarraingthe de réir scála.
Áirítear leis an bhfearann ​​​​4HB de SPACA6 ceithre phríomh-helices (helices 1-4), atá eagraithe i bhfoirm héilics helical (Fíor 2a), alternating idir idirghníomhaíochtaí antiparallel agus comhthreomhar (Fig. 2b).Tá héilics aon chasadh beag breise (helix 1′) leagtha ingearach leis an mbeart, agus é ina thriantán le héilí 1 agus 2. Tá an triantán seo dífhoirmithe beagán i bpacáil héiliceach twisted an phacáil sách dlúth de héilí 3 agus 4 ( Fíor 2a).
4HB N-críochfort stiall-chairt.b Radharc ar bharr beart de cheithre héilice, gach héilics aibhsithe le gorm dorcha ag an gcríochfort N agus dearg dorcha ag an gcríochfort C.c Léaráid rotha bíseach ón mbarr anuas do 4HB, agus gach iarmhar léirithe mar chiorcal lipéadaithe le cód aimínaigéad aonlitir;ní dhéantar ach na ceithre aimínaigéad ag barr an rotha a uimhriú.Tá iarmhair neamhpholacha daite buí, tá iarmhair neamhluchtaithe polar daite glas, tá iarmhair a luchtaítear go dearfach daite gorm, agus tá dath dearg ar iarmhair a luchtaítear go diúltach.d Aghaidheanna triantánacha an fhearainn 4HB, le 4HBanna in oráiste agus insí glasa.Léiríonn an dá inset bannaí disulfide slat-chruthach.
Tá 4HB dírithe ar chroílár hidreafóbach laistigh atá comhdhéanta den chuid is mó d'iarmhair alafatacha agus aramatacha (Fíor 2c).Tá nasc díshulfíde sa chroílár idir Cys41 agus Cys55 a nascann héilís 1 agus 2 le chéile i dtriantán ardaithe uachtarach (Fíor 2d).Cruthaíodh dhá nasc disulfide breise idir an móitíf CXXC i Helix 1′ agus móitíf CXXC eile a fuarthas ag barr an β-hairpin sa réigiún hinge (Fíor 2d).Tá iarmhar coimeádach arginine le feidhm anaithnid (Arg37) suite taobh istigh de thriantán log déanta ag héilí 1′, 1, agus 2. Idirghníomhaíonn adaimh charbóin alafatacha Cβ, Cγ, agus Cδ Arg37 leis an gcroílár hidreafóbach, agus bogann a ghrúpaí guanidine go timthriallach. idir helices 1′ agus 1 trí idirghníomhaíochtaí idir cnámh droma Thr32 agus slabhra taobh (Fíor S5a,b).Síneann Tyr34 isteach sa chuas ag fágáil dhá chuas bheaga trína bhféadfaidh Arg37 idirghníomhú leis an tuaslagóir.
Is éard atá i bhfearainn β-ceapaire cosúil le Ig ná sártheaghlach próitéiní a roinneann an ghné choitianta de dhá bhileog β amfafaiceacha ilshnáithe nó níos mó a idirghníomhaíonn trí chroílár hidreafóbach 39. Tá an patrún céanna ag fearann ​​C-críochfort Ig-cosúil le SPACA6. agus tá sé comhdhéanta de dhá shraith (Fíor S6a).Is bileog β é Bileog 1 de cheithre shnáithe (snáitheanna D, F, H, agus I) ina ndéanann snáitheanna F, H, agus I socrú frith-chomhthreomhar, agus déanann snáitheanna I agus D idirghníomhaíocht chomhthreomhar.Is bileog bheag beta snáithe dúbailte frith-chomhthreomhar é Tábla 2 (snáitheanna E agus G).Breathnaíodh nasc disulfide inmheánach idir an C-críochfort an slabhra E agus lár an slabhra H (Cys170-Cys226) (Fíor S6b).Tá an nasc déshulfíde seo ar aon dul leis an nasc déshulfíde san fhearann ​​β-ceapaire d'imdhíon-ghlóbailin40,41.
Casann an leathán β ceithre shnáithe feadh a fad iomlán, ag cruthú imill neamhshiméadracha atá difriúil ó thaobh cruth agus leictreastatach.Is dromchla comhréidh comhshaoil ​​hidreafóbach é an imeall níos tanaí a sheasann amach i gcomparáid leis na dromchlaí míchothroma agus ilghnéitheacha leictreastatacha atá fágtha i SPACA6 (Fíor S6b,c).Timpeallaíonn Halo de charbónail/aimínghrúpaí cnámh droma nochta agus slabhraí taobh Polar an dromchla hidreafóbach ( Fíor. S6c ).Tá an corrlach níos leithne clúdaithe ag teascán héiliceach caipínithe a bhlocálann an chuid N-críochfort den chroí hidreafóbach agus a fhoirmíonn trí nasc hidrigine le grúpa polar oscailte cnámh droma slabhra F (Fíor S6d).Cruthaíonn an chuid C-críochfort den chiumhais seo póca mór le croí hidrofóbach atá nochta go páirteach.Tá an póca timpeallaithe ag muirir dearfacha mar gheall ar thrí shraith d'iarmhair arginine dúbailte (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 agus Arg212-Arg214) agus histidine lárnach (His220) (Fíor S6e).
Is teascán gearr é an réigiún hinge idir an fearann ​​helical agus an fearann ​​cosúil le Ig, comhdhéanta de β-ciseal trí-shnáithe frith-chomhthreomhar (snáitheanna A, B agus C), héilics beag 310, agus roinnt deighleoga helical randamach fada.(Fig. S7).Is cosúil go ndéanann líonra de theagmhálacha comhfhiúsacha agus leictreastatacha sa réigiún hinge an treoshuíomh idir 4HB agus an fearann ​​atá cosúil le Ig a chobhsú.Is féidir an líonra a roinnt ina thrí chuid.Áiríonn an chéad chuid dhá mhóitíf CXXC (27CXXC30 agus 139CXXC142) a fhoirmíonn péire de bhannaí déshuilfíde idir an β-hairpin san inse agus an helix 1′ i 4HB.Áirítear sa dara cuid idirghníomhaíochtaí leictreastatacha idir an bhfearann ​​​​cosúil le Ig agus an hinge.Cruthaíonn Glu132 sa inse droichead salainn le Arg233 san fhearann ​​cosúil le Ig agus Arg135 san inse.Áirítear sa tríú cuid nasc comhfhiúsach idir an fearann ​​cosúil le Ig agus an réigiún hinge.Ceanglaíonn dhá bhanna disulfide (Cys124-Cys147 agus Cys128-Cys153) an lúb hinge le nascóir atá cobhsaithe ag idirghníomhaíochtaí leictreastatacha idir Gln131 agus an grúpa feidhme cnámh droma, rud a ligeann rochtain ar an gcéad fhearann ​​​​cosúil le Ig.slabhra.
Baineadh úsáid as struchtúr ectdomain SPACA6 agus struchtúir aonair na bhfearainn 4HB agus Ig-mhaith chun cuardach a dhéanamh ar thaifid a bhfuil struchtúr cosúil leo i mbunachair shonraí próitéine 42 .D'aithníomar meaitseanna le scóir arda Dali Z, diallais chaighdeánacha beaga, agus scóir mhóra LALI (is é an dara ceann líon na n-iarmhar coibhéiseach ó thaobh struchtúir).Cé go raibh scór Z inghlactha de >842 ag an gcéad 10 amas ón gcuardach ectodomain iomlán (Tábla S1), léirigh cuardach ar fhearann ​​cosúil le 4HB nó Ig amháin gur fhreagraíonn formhór na n-amas seo do β-ceapairí amháin.huaire uileláithreach a fhaightear i go leor próitéiní.Níor tháinig ach toradh amháin ar na trí chuardach i Dali: IZUMO1.
Tá sé molta le fada go mbeadh cosúlachtaí struchtúracha ag SPACA6 agus IZUMO17,32,37.Cé nach roinneann ectodomains an dá phróitéin seo a bhaineann le comhleá gaiméit ach 21% céannacht seicheamh (Fíor S8a), cheadaigh fianaise chasta, lena n-áirítear patrún bannaí disulfide caomhnaithe agus fearann ​​​​cosúil le C-críochfort tuartha i SPACA6, iarrachtaí luatha a thógáil. samhail homology de luch A a SPACA6 ag baint úsáide as IZUMO1 mar theimpléad37.Deimhníonn ár struchtúr na réamh-mheastacháin seo agus léiríonn sé fíorchéim na cosúlachta.Go deimhin, roinneann na struchtúir SPACA6 agus IZUMO137,43,44 an ailtireacht dhá-fhearann ​​​​céanna (Fíor S8b) le fearainn β-ceapaire cosúil le 4HB agus Ig-mhaith ceangailte ag réigiún hinge ( Fíor. S8c).
Tá difríochtaí coitianta ag IZUMO1 agus SPACA6 4HB ó ghnáthbhearta bíseach.Tá 4HBanna tipiciúla, cosúil leis na cinn a fuarthas i gcoimpléisc próitéine SNARE a bhfuil baint acu le comhleá endosomal 45,46, tar éis héilíosanna spásáilte go cothrom a chothabháil cuaire leanúnach timpeall ais lárnach 47. I gcodarsnacht leis sin, rinneadh na fearainn helical i IZUMO1 agus SPACA6 araon a shaobhadh, le cuaire athraitheach agus pacáil míchothrom (Fíor S8d).Coinnítear an casadh, is dócha gurb é an triantán a foirmíodh le héilic 1′, 1 agus 2, in IZUMO1 agus SPACA6 agus déantar é a chobhsú ag an móitíf CXXC céanna ar héilics 1′.Mar sin féin, cruthaíonn an nasc disulfide breise a fhaightear i SPACA6 (Cys41 agus Cys55 a nascann héilí 1 agus 2 thuas go comhfhiúsach) APEX níos géire ag APEX an triantáin, rud a fhágann go bhfuil SPACA6 níos casta ná IZUMO1, le triantáin chuas níos suntasaí.Ina theannta sin, níl Arg37 ag IZUMO1 a breathnaíodh i lár an chuas seo i SPACA6.I gcodarsnacht leis sin, tá croí hidrofóbach níos tipiciúla ag IZUMO1 d’iarmhair alafatacha agus aramatacha.
Tá fearann ​​cosúil le Ig ag IZUMO1 atá comhdhéanta de β-bileog le snáithe dúbailte agus cúig shnáithe43.Tagann an snáithe breise in IZUMO1 in ionad an choil i SPACA6, a idirghníomhaíonn leis an snáithe F chun bannaí hidrigine cnámh droma sa snáithe a theorannú.Pointe comparáide suimiúil is ea an muirear dromchla tuartha ar na fearainn atá cosúil le Ig den dá phróitéin.Tá an dromchla IZUMO1 luchtaithe níos diúltach ná an dromchla SPACA6.Tá muirear breise suite in aice leis an teirminéal C atá os comhair an membrane sperm.I SPACA6, bhí na réigiúin chéanna níos neodrach nó níos dearfaí (Fíor S8e).Mar shampla, tá an dromchla hidreafóbach (imill níos tanaí) agus claiseanna luchtaithe go dearfach (imill níos leithne) i SPACA6 luchtaithe go diúltach in IZUMO1.
Cé go bhfuil an gaol agus na heilimintí struchtúir tánaisteacha idir IZUMO1 agus SPACA6 caomhnaithe go maith, léirigh ailíniú struchtúrach na bhfearann ​​​​cosúil le Ig go bhfuil difríocht idir an dá fhearann ​​ina dtreoshuíomh ginearálta i gcomparáid lena chéile ( Fíor. S9 ).Tá an beart bíseach IZUMO1 cuartha thart ar an β-ceapaire, rud a chruthaíonn an cruth “boomerang” a thuairiscítear roimhe seo thart ar 50° ón ais lárnach.I gcodarsnacht leis sin, bhí an léas helical i SPACA6 claonta thart ar 10° sa treo eile.Is dócha go mbeidh na difríochtaí sna treoshuímh seo mar gheall ar dhifríochtaí sa réigiún hinge.Ag leibhéal an tseichimh phríomha, is beag cosúlachtaí seichimh atá ag IZUMO1 agus SPACA6 ag an inse, cé is moite d’iarmhair cistéin, glicín agus d’aigéad aspartach.Mar thoradh air sin, tá bannaí hidrigine agus líonraí leictreastatacha go hiomlán difriúil.Tá eilimintí struchtúr tánaisteacha β-bileog roinnte ag IZUMO1 agus SPACA6, cé go bhfuil na slabhraí in IZUMO1 i bhfad níos faide agus go bhfuil an 310 helix (helix 5) uathúil do SPACA6.Mar thoradh ar na difríochtaí seo tá treoshuíomhanna éagsúla fearainn do dhá phróitéin atá cosúil lena chéile.
Nocht ár gcuardach freastalaí Dali gurb iad SPACA6 agus IZUMO1 an t-aon dá struchtúr a chinntear go turgnamhach atá stóráilte sa bhunachar sonraí próitéine a bhfuil an huaire 4HB áirithe seo (Tábla S1).Níos déanaí, d'fhorbair DeepMind (Aibidil/Google) AlphaFold, córas néarbhunaithe atá bunaithe ar líonra a fhéadfaidh struchtúir 3D próitéiní ó sheichimh phríomha a thuar go cruinn48.Go gairid tar éis dúinn struchtúr SPACA6 a réiteach, eisíodh bunachar sonraí AlphaFold, ag soláthar samhlacha struchtúir thuarthacha a chlúdaíonn 98.5% de na próitéiní go léir sa phróitéama daonna48,49.Ag baint úsáide as ár struchtúr SPACA6 réitithe mar shamhail chuardaigh, d'aithin cuardach struchtúrach homaleolaíochta don tsamhail i bpróitéam daonna AlphaFold iarrthóirí a bhféadfadh cosúlachtaí struchtúracha a bheith acu le SPACA6 agus IZUMO1.Mar gheall ar chruinneas dochreidte AlphaFold maidir le SPACA6 (Fíor S10a) a thuar - go háirithe an ectodomain 1.1 Å rms i gcomparáid lenár struchtúr réitithe (Fíor S10b) - is féidir linn a bheith muiníneach gur dócha go mbeidh na meaitseanna SPACA6 aitheanta cruinn.
Roimhe seo, rinne PSI-BLAST cuardach ar bhraisle IZUMO1 le trí phróitéin eile a bhaineann le sperm: IZUMO2, IZUMO3, agus IZUMO450.Thuar AlphaFold go bhfillteann na próitéiní teaghlaigh IZUMO seo isteach i bhfearann ​​​​4HB leis an bpatrún bannaí disulfide céanna le IZUMO1 (Fíoracha 3a agus S11), cé nach bhfuil fearann ​​cosúil le Ig acu.Tá sé hipitéiseach gur próitéiní membrane aon-thaobh iad IZUMO2 agus IZUMO3 cosúil le IZUMO1, agus is cosúil go bhfuil IZUMO4 rúnda.Níor socraíodh feidhmeanna próitéiní IZUMO 2, 3, agus 4 i gcomhleá gaiméití.Is eol go bhfuil ról ag IZUMO3 i mbithgenesis acrosóim le linn fhorbairt speirm51 agus fuarthas amach go bhfuil an próitéin IZUMO ina choimpléasc50.Tugann caomhnú próitéiní IZUMO i mamaigh, reiptílí agus amfaibiaigh le fios go bhfuil a bhfeidhm fhéideartha ag teacht le feidhm phróitéiní eile atá ar eolas a bhaineann le comhleá gaiméite, mar DCST1/2, SOF1, agus FIMP.
Léaráid d'ailtireacht fearainn an tsártheaghlaigh IST, le fearainn 4HB, hinge, agus Ig aibhsithe in oráiste, glas agus gorm, faoi seach.Tá réigiún uathúil C-críochfort ag IZUMO4 a fhéachann dubh.Léirítear naisc dhéshulfíde dearbhaithe agus tuartha le línte soladacha agus poncaithe, faoi seach.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F15), DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) ar taispeáint sa raon dath céanna le painéal A. Taispeántar bannaí disulfide i magenta.Ní thaispeántar helices transmembrane TMEM95, IZUMO2 agus IZUMO3.
Murab ionann agus an próitéin IZUMO, próitéiní SPACA eile (ie, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, agus SPACA9) a chreidtear a bheith difriúil ó thaobh struchtúir de SPACA6 (Fíor S12).Níl ach 4HB ag SPACA9, ach níltear ag súil go mbeidh an treoshuíomh comhthreomhar-frith-chomhthreomhar céanna aige nó an banna déshhuilfíde céanna le SPACA6.Níl ach fearann ​​cosúil le Ig ag SPACA1.Tá sé tuartha ag AlphaFold go bhfuil struchtúr iomlán difriúil ag SPACA3, SPACA4 agus SPACA5 ná SPACA6.Is díol spéise é go bhfuil ról ag SPACA4 freisin i toirchiú, ach go pointe níos mó ná SPACA6, ina ionad sin ag éascú an idirghníomhaíocht idir sperm agus úicítí zona pellucida52.
D'aimsigh ár gcuardach AlphaFold meaitseáil eile do IZUMO1 agus SPACA6 4HB, TMEM95.Fágann TMEM95, próitéin trasmembrane amháin a bhaineann go sonrach le sperm, le lucha fireanna neamhthorthúil nuair a bhíonn siad 32,33.Bhí gnáth-mhoirfeolaíocht, motility, agus an cumas chun dul isteach sa zona pellucida agus ceangal leis an membrane ubhagán spermatozoa TMEM95, ach níorbh fhéidir comhleá leis an scannán úicítí.Léiríodh i staidéir roimhe seo go bhfuil cosúlachtaí struchtúracha ag TMEM95 agus IZUMO133.Go deimhin, dheimhnigh an tsamhail AlphaFold go bhfuil TMEM95 ina 4HB leis an péire céanna móitífeanna CXXC mar IZUMO1 agus SPACA6 agus an banna disulfide breise céanna idir helices 1 agus 2 le fáil i SPACA6 (Fíor 3a agus S11).Cé nach bhfuil fearann ​​cosúil le Ig ag TMEM95, tá réigiún aige le patrún bannaí díshulfíde cosúil leis na réigiúin inse SPACA6 agus IZUMO1 (Fíor 3b).Ag am foilsithe na lámhscríbhinne seo, thuairiscigh an freastalaí réamhphriontála struchtúr TMEM95, ag deimhniú an toradh AlphaFold53.Tá TMEM95 an-chosúil le SPACA6 agus IZUMO1 agus tá sé caomhnaithe go héabhlóideach cheana féin in amfaibiaigh (Fíor 4 agus S13).
Bhain an cuardach PSI-BLAST úsáid as bunachair shonraí NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, agus SOF1 chun suíomh na sraitheanna seo i gcrann na beatha a chinneadh.Ní thaispeántar faid idir pointí brainse de réir scála.
Tugann na cosúlachtaí struchtúracha iontacha foriomlána idir SPACA6 agus IZUMO1 le fios go bhfuil siad ina gcomhaltaí de bhunaitheoirí de supertheaghlach struchtúrach caomhnaithe a chuimsíonn na próitéiní TMEM95 agus IZUMO 2, 3, agus 4.baill aitheanta: IZUMO1, SPACA6 agus TMEM95.Toisc nach bhfuil ach fearainn cosúil le Ig ag dornán ball, is é sainmharc an supertheaghlaigh IST ná an fearann ​​4HB, a bhfuil gnéithe uathúla atá i gcoiteann leis na próitéiní seo go léir: 1) 4HB coiled le héilíosanna eagraithe i malairt chomhthreomhar/comhthreomhar (Fig. 5a), 2) tá aghaidh thriantánach ar an gcuach comhdhéanta de dhá héilí laistigh den bheart agus an tríú héilics ingearach (Fíor-réimse eochair (Fíor 5c). mar braiteoir redox 54,55,56 , agus is féidir an móitíf i mbaill teaghlaigh IST a bheith bainteach le isiméiris díshulfíde próitéine ar nós ERp57 i gcomhleá gaiméití.
Sainmhínítear baill den superteaghlach IST ag trí ghné shaintréithe d'fhearann ​​4HB: ceithre héileacaptar ag malartú idir treoshuíomh comhthreomhar agus frith-chomhthreomhar, aghaidheanna cuachta helical ba-triantánacha, agus móitíf dúbailte ca CXXC déanta idir móilíní beaga.) Helixes N-críochfort (oráiste) agus réigiún hinge β-hairpin (glas).
I bhfianaise na cosúlachtaí idir SPACA6 agus IZUMO1, rinneadh tástáil ar chumas na gceann roimhe sin ceangal a dhéanamh le IZUMO1 nó JUNO.Is modh ceangailteach cinéiteach-bhunaithe é interferometry Biolayer (BLI) a úsáideadh roimhe seo chun an idirghníomhaíocht idir IZUMO1 agus JUNO a chainníochtú.Tar éis gortú an bhraiteora lipéadaithe biotin le IZUMO1 mar bhaoite le tiúchan ard d'anailísí JUNO, braitheadh ​​comhartha láidir (Fíor S14a), rud a léiríonn athrú ceangailteach-spreagtha i dtiús an bhithábhair atá ceangailte le barr an bhraiteora.Comharthaí comhchosúla (ie, JUNO cúpláilte leis an braiteoir mar bhaoite i gcoinne anailít IZUMO1) (Fíor S14b).Níor aimsíodh aon chomhartha nuair a úsáideadh SPACA6 mar anailít i gcoinne IZUMO1 atá faoi cheangal braiteoir nó JUNO atá faoi cheangal braiteoir (Fíor S14a,b).Léiríonn easpa an chomhartha seo nach n-idirghníomhaíonn fearann ​​eischeallach SPACA6 le fearann ​​eischeallach IZUMO1 nó JUNO.
Toisc go bhfuil an measúnú BLI bunaithe ar bhitinylation na n-iarmhar lísín saor in aisce ar an próitéin bhaoite, is féidir leis an modhnú seo cosc ​​a chur le ceangailteach má tá iarmhair lísín páirteach san idirghníomhaíocht.Ina theannta sin, is féidir le treoshuíomh an cheangail i gcoibhneas leis an braiteoir bacainní steiriúla a chruthú, agus mar sin deineadh gnáth-thástálacha tarraingthe anuas ar na hectodomains SPACA6, IZUMO1 agus JUNO athchuingreach.In ainneoin seo, níor deascadh SPACA6 le His-clib IZUMO1 nó His-clib JUNO (Fíor S14c,d), rud a thugann le fios nach raibh aon idirghníomhaíocht ar bith ag teacht leis an gceann a breathnaíodh i dturgnaimh BLI.Mar rialú dearfach, dheimhnigh muid idirghníomhú JUNO leis an lipéad A IZUMO1 (Figiúirí S14e agus S15).
In ainneoin na cosúlachtaí struchtúracha idir SPACA6 agus IZUMO1, ní haon ionadh é neamhábaltacht SPACA6 JUNO a cheangal.Tá níos mó ná iarmhar 20 ag dromchla IZUMO1 daonna a idirghníomhaíonn le JUNO, lena n-áirítear iarmhair ó gach ceann de na trí réigiún (cé go bhfuil an chuid is mó acu suite sa réigiún hinge) (Fíor S14f).As na hiarmhair seo, níl ach ceann amháin caomhnaithe i SPACA6 (Glu70).Cé gur choinnigh go leor ionadú iarmhar a n-airíonna bithcheimiceacha bunaidh, cuireadh an Asp148 in SPACA6 ar a raibh luchtaithe diúltach in ionad an iarmhair riachtanach Arg160 in IZUMO1;léirigh staidéir roimhe seo go gcuireann an sóchán Arg160Glu in IZUMO1 deireadh beagnach go hiomlán leis an gceangal le JUNO43.Ina theannta sin, mhéadaigh an difríocht i dtreoshuíomh fearainn idir IZUMO1 agus SPACA6 go suntasach an t-achar dromchla ar shuíomh JUNO-ceangailteach an réigiúin choibhéisigh ar SPACA6 (Fíor S14g).
In ainneoin an ghá atá le SPACA6 le haghaidh comhleá gaiméití agus a chosúlacht le IZUMO1, ní cosúil go bhfuil feidhm cheangailteach JUNO choibhéiseach ag SPACA6.Dá bhrí sin, tá iarracht déanta againn ár sonraí struchtúracha a chomhcheangal le fianaise ar thábhacht a sholáthraíonn an bhitheolaíocht éabhlóideach.Léiríonn ailíniú seicheamhach homalóga SPACA6 caomhnú an struchtúir choitinn lasmuigh de mhamaigh.Mar shampla, tá iarmhair cistéin i láthair fiú i amfaibiaigh a bhaineann i bhfad i gcéin (Fíor 6a).Ag baint úsáide as an bhfreastalaí ConSurf, mapáladh sonraí coinneála ailínithe iolracha de 66 seicheamh chuig dromchla SPACA6.Is féidir leis an gcineál seo anailíse a thaispeáint cé na hiarmhair a caomhnaíodh le linn éabhlóid próitéine agus is féidir a léiriú cé na réigiúin dromchla a bhfuil ról acu i bhfeidhm.
a Ailíniú seicheamhach d'ectodomain SPACA6 ó 12 speiceas éagsúla ullmhaithe ag baint úsáide as CLUSTAL OMEGA.De réir anailís ConSurf, tá na poist is coimeádaí marcáilte le gorm.Aibhsítear iarmhair cistéin i dearg.Taispeántar teorainneacha fearainn agus gnéithe tánaisteacha struchtúir ag barr an ailínithe, áit a léiríonn saigheada snáitheanna β agus léiríonn tonnta helices.Is iad seo a leanas na hAitheantóirí Rochtana NCBI ina bhfuil na seichimh: daonna (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), moncaí capuchin (Cebus mimic, XP_017359366), marú capall (Equus_023e, XP6, nó marú). 3 XP_032_034) .), caoirigh (Ovis aries, XP_014955560), eilifint (Loxodonta africana, XP_010585293), madra (Canis lupus familyis, XP_025277208), luch (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanian diabhal_03, XPSarcop_1, Tasmanian diabhal , 8) , 61_89 agus Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Tá an t-uimhriú bunaithe ar ord an duine.b Léiriú dromchla ar struchtúr SPACA6 le 4HB ag an mbarr agus fearann ​​cosúil le Ig ag an mbun, dathanna bunaithe ar mheastacháin caomhnaithe ón bhfreastalaí ConSurf.Tá na codanna is fearr leasaithe i gorm, tá na codanna measartha caomhnaithe i mbán, agus tá na cinn is lú caomhnaithe i buí.cistéin corcra.Taispeántar trí phaistí dromchla a thaispeánann ardleibhéal cosanta sna paistí lipéadaithe inset 1, 2 agus 3. Taispeántar cartún 4HB sa inset ag barr ar dheis (scéim dathanna céanna).
Tá trí réigiún dromchla an-chaomhnaithe ag struchtúr SPACA6 (Fíor 6b).Cuimsíonn Paiste 1 4HB agus an réigiún insí agus tá dhá dhroichead déshalfíde CXXC caomhnaithe ann, líonra inse Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (Fíor S7), agus trí iarmhair aramatacha sheachtracha caomhnaithe (Phe31, Tyr73, Phe137)).imeall níos leithne den fhearann ​​cosúil le Ig (Fíor S6e), a sheasann do roinnt iarmhair a ghearrtar go dearfach ar dhromchla na speirme.Suimiúil go leor, tá eipitope antasubstainte sa phaiste seo a léiríodh roimhe seo go gcuireann sé isteach ar fheidhm SPACA6 30.Cuimsíonn Réigiún 3 an t-insí agus taobh amháin den fhearann ​​cosúil le Ig;cuimsíonn an réigiún seo prolines caomhnaithe (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) agus iarmhair polaraithe/luchtaithe amach.Ionadh, tá an chuid is mó de na hiarmhair ar dhromchla 4HB an-athraitheach (Fig. 6b), cé go bhfuil an huaire a chaomhnú ar fud an homologue SPACA6 (mar atá léirithe ag an coimeádachas an croí bundle hidreafóbach) agus níos faide ná an superfamily IST.
Cé gurb é seo an réigiún is lú i SPACA6 leis an líon is lú gnéithe struchtúir tánaisteacha inbhraite, tá go leor iarsmaí de réigiúin insí (lena n-áirítear réigiún 3) caomhnaithe go mór i measc homologues SPACA6, rud a d'fhéadfadh a léiriú go bhfuil ról ag treoshuíomh an chuachta helical agus β-ceapaire.mar coimeádach.Mar sin féin, in ainneoin an nascáil hidrigine fhairsing agus líonraí leictreastatacha sa réigiún inse de SPACA6 agus IZUMO1, is féidir fianaise ar sholúbthacht intreach a fheiceáil i ailíniú na struchtúir iolracha ceadaithe de IZUMO137,43,44.Rinne ailíniú na bhfearann ​​aonair forluí go maith, ach bhí treoshuíomh na bhfearann ​​i gcomparáid lena chéile éagsúil ó 50 ° go 70 ° ón ais lárnach ( Fíor. S16 ).Chun tuiscint a fháil ar dhinimic comhfhoirmiúil SPACA6 i dtuaslagán, rinneadh turgnaimh SAXS (Fíor S17a, b).Ab initio atógáil an ectodomain SPACA6 conformed le struchtúr criostail slat (Fig. S18), cé gur léirigh an plota Kratky roinnt solúbthachta (Fíor S17b).Tá an comhfhoirmiú seo i gcodarsnacht le IZUMO1, ina nglacann an phróitéin neamhcheangailte cruth búmarang sa laitís agus sa tuaslagán araon43.
Chun an réigiún solúbtha a shainaithint go sonrach, rinneadh mais-speictreascópacht malartaithe hidrigine-deoitéiriam (H-DXMS) ar SPACA6 agus cuireadh i gcomparáid é le sonraí a fuarthas roimhe seo ar IZUMO143 (Fíor 7a,b).Is léir go bhfuil SPACA6 níos solúbtha ná IZUMO1, mar is léir ón malartú deoitéiriam níos airde ar fud an struchtúir tar éis 100,000 s malairte.Sa dá struchtúr, taispeánann an chuid C-críochfort den réigiún hinge ardleibhéal malairte, rud a cheadaíonn rothlú teoranta fearainn 4HB agus Ig-mhaith i gcoibhneas lena chéile.Suimiúil go leor, tá an chuid C-críochfort den inse SPACA6, comhdhéanta d'iarmhar 147CDLPLDCP154, ina réigiún an-chaomhnaithe 3 (Fíor 6b), rud a thugann le fios b'fhéidir go bhfuil solúbthacht idirfhearann ​​ina ghné de SPACA6 a chaomhnaítear go héabhlóideach.De réir na hanailíse solúbthachta, léirigh sonraí leá teirmeach CD go bhfuil SPACA6 (Tm = 51.2°C) níos lú cobhsaí ná IZUMO1 (Tm = 62.9°C) (Fíor S1e agus S19).
a íomhánna H-DXMS de SPACA6 agus b IZUMO1.Socraíodh an céatadán malairte deoitéiriam ag na pointí ama sonraithe.Léirítear leibhéil malartaithe hidrigine-deoitéiriam de réir datha ar scála grádáin ó ghorm (10%) go dearg (90%).Is ionann boscaí dubha agus réimsí malartaithe ard.Taispeántar teorainneacha an fhearainn cosúil le 4HB, hinge agus Ig a breathnaíodh sa struchtúr criostail os cionn an tseichimh phríomha.Breacadh leibhéil malairte deoitéiriam ag 10 s, 1000 s, agus 100,000 s ar stiall-chairt a bhí forshuite ar dhromchlaí móilíneacha trédhearcacha SPACA6 agus IZUMO1.Tá codanna de struchtúir a bhfuil leibhéal malairte deoitéiriam faoi bhun 50% daite bán.Tá limistéir os cionn 50% malairte H-DXMS daite i scála grádán.
Mar gheall ar úsáid straitéisí géiniteacha CRISPR/Cas9 agus géine luiche, sainaithníodh roinnt fachtóirí atá tábhachtach do cheangal agus comhleá speirm agus uibheacha.Seachas an t-idirghníomhú dea-thréithrithe idir struchtúr IZUMO1-JUNO agus CD9, tá an chuid is mó de na próitéiní a bhaineann le comhleá gaiméití fós enigmatic ó thaobh struchtúir agus feidhme.Is píosa eile den bhfreagra móilíneach greamaitheachta/comhleá le linn toirchithe é tréithriú bithfhisiceach agus struchtúrach SPACA6.
Is cosúil go bhfuil an-chaomhnú ag SPACA6 agus baill eile de theaghlach IST i mamaigh chomh maith le héin aonair, reiptílí agus amfaibiaigh;go deimhin, ceaptar go bhfuil gá le SPACA6 fiú le haghaidh toirchithe i séabra 59. Tá an dáileadh seo cosúil le próitéiní eile a bhfuil baint acu le comhleá gaiméitigh ar nós DCST134, DCST234, FIMP31, agus SOF132, rud a thugann le tuiscint go bhfuil na fachtóirí seo easnamhach HAP2 (freisin). ar a dtugtar GCS1) próitéiní atá freagrach as gníomhaíocht catalaíoch go leor protists., plandaí, agus artrapóid.Próitéiní comhleá toirchithe 60, 61. In ainneoin na cosúlachtaí láidir struchtúracha idir SPACA6 agus IZUMO1, d'eascair neamhthorthúlacht i lucha fireann mar thoradh ar ghiniúint géinte a d'ionchódú ceachtar de na próitéiní seo, rud a léiríonn nach ndéantar a gcuid feidhmeanna i gcomhleá gaiméití a mhacasamhlú..Ar bhonn níos leithne, níl aon cheann de na próitéiní sperm atá ar eolas atá riachtanach don chéim greamaitheachta den chomhleá iomarcach.
Tá sé fós ina cheist oscailte an bhfuil SPACA6 (agus baill eile den supertheaghlach IST) rannpháirteach in acomhail idirgaiméadacha, ag cruthú líonraí intragaiméadacha chun próitéiní tábhachtacha a earcú chuig pointí comhleá, nó b'fhéidir fiú gníomhú mar fhusogens do-ghlactha.Léirigh staidéir chomh-imdhíonachta i gcealla HEK293T idirghníomhaíocht idir IZUMO1 fad iomlán agus SPACA632.Mar sin féin, níor idirghníomhaigh ár n-ectodomains athchuingreach in vitro, rud a thugann le tuiscint go raibh na hidirghníomhaíochtaí le feiceáil i Noda et al.scriosadh an dá cheann sa tógáil (tabhair faoi deara eireaball cíteaplasma IZUMO1, a bhfuil sé léirithe nach bhfuil gá leis le haghaidh toirchithe62).De rogha air sin, d’fhéadfadh go mbeadh timpeallachtaí ceangailteacha ar leith ag teastáil ó IZUMO1 agus/nó SPACA6 nach ndéanaimid atáirgeadh in vitro, amhail comhréireanna fiseolaíocha sonracha nó coimpléisc mhóilíneacha ina bhfuil próitéiní eile (aitheanta nó nach bhfuarthas amach go fóill).Cé go gcreidtear go ndéanann ectodomain IZUMO1 idirghabháil spermatozoa a cheangal leis an ubh sa spás perivitelline, níl cuspóir an ectodomain SPACA6 soiléir.
Nochtann struchtúr SPACA6 roinnt dromchlaí caomhnaithe a d’fhéadfadh baint a bheith acu le hidirghníomhaíochtaí próitéine-próitéine.Tá roinnt iarmhair aramatacha a fhéachann amach amach sa chuid chaomhnaithe den réigiún hinge atá díreach in aice leis an móitíf CXXC (ainmnithe Paiste 1 thuas) a bhaineann go minic le hidreafóbacha agus idirghníomhaíochtaí cruachta π idir bithmhóilíní.Cruthaíonn taobhanna leathana an fhearainn cosúil le Ig (réigiún 2) groove luchtaithe go dearfach le Arg agus a chuid iarmhair atá an-chaomhnaithe, agus úsáideadh antasubstaintí i gcoinne an réigiúin seo roimhe seo chun comhleá gaiméit 30 a bhlocáil.Aithníonn an antashubstaint an epitope líneach 212RIRPAQLTHRGTFS225, a bhfuil trí cinn de na sé iarmhar arginine agus His220 an-chaomhnaithe.Níl sé soiléir an bhfuil an mhífheidhm mar gheall ar bhac na n-iarmhar sonrach seo nó ar an réigiún ar fad.Léiríonn suíomh na bearna seo in aice le críochfort C an ceapaire β cis-idirghníomhaíochtaí le próitéiní sperm comharsanacha, ach ní le próitéiní úicítí.Ina theannta sin, d’fhéadfadh coinneáil tangle an-solúbtha proline-saibhir (suíomh 3) laistigh den inse a bheith ina shuíomh idirghníomhaithe próitéine-próitéine nó, níos dóichí, go léireodh sé go gcoimeádtar solúbthacht idir an dá réimse.Tá inscne tábhachtach do ról anaithnid SPACA6.comhleá gaiméití.
Tá airíonna ag SPACA6 de phróitéiní greamaitheachta idircheallacha, lena n-áirítear β-ceapairí cosúil le Ig.Tá fearann ​​β-ceapaire amháin nó níos mó ag go leor próitéiní greamaitheacha (m.sh., cadherins, integrins, adhesins, agus IZUMO1) a shíneann próitéiní ón scannán cille chuig a spriocanna comhshaoil63,64,65.I bhfearann ​​cosúil le Ig de SPACA6 tá móitíf a fhaightear go coitianta i β-ceapairí greamaitheachta agus comhtháthaithe: dúbailteacha de shnáitheanna comhthreomhara ag foircinn β-ceapairí, ar a dtugtar teanntáin mheicniúla66.Creidtear go méadaíonn an móitíf seo an fhriotaíocht in aghaidh fórsaí lomadh, rud atá luachmhar do phróitéiní a bhfuil baint acu le hidirghníomhaíochtaí idircheallacha.Mar sin féin, in ainneoin na cosúlachtaí seo le hadhesins, níl aon fhianaise ann faoi láthair go n-idirghníomhaíonn SPACA6 le bánna uibhe.Níl an ectodomain SPACA6 in ann ceangal a dhéanamh le JUNO, agus is ar éigean a idirghníomhaíonn SPACA6 cealla HEK293T, mar a thaispeántar anseo, le úicítí nach bhfuil crios 32 ann.Má bhunaíonn SPACA6 bannaí idirgaiméadacha, d’fhéadfadh go mbeadh gá le modhnuithe iar-aistrithe nó go ndéanfaí iad a chobhsú le próitéiní speirme eile.Chun tacú leis an hipitéis deiridh, ceanglaíonn spermatozoa easnamhach IZUMO1 d'úicítí, rud a léiríonn go bhfuil baint ag móilíní seachas IZUMO1 le céim ghreamaithe gaiméit 27 .
Tá airíonna ag go leor próitéiní comhleá víreasacha, ceallacha agus forbartha a thuar a bhfeidhm mar fhusogens.Mar shampla, tá glycoproteiní comhleá víreasacha (aicmí I, II agus III) ag peptide nó lúb comhleá hidreafóbach ag deireadh an phróitéin a chuirtear isteach sa membrane óstach.Níor léirigh léarscáil hydrophilicity IZUMO143 agus struchtúr (cinneadh agus tuartha) an superfamily IST aon peptide comhleá hidreafóbach dealraitheach.Mar sin, má fheidhmíonn próitéiní ar bith san superteaghlach IST mar fhusogens, déanann siad amhlaidh ar bhealach atá difriúil ó shamplaí aitheanta eile.
Mar fhocal scoir, is rúndiamhair spleodrach fós iad feidhmeanna chomhaltaí superteaghlaigh IST na bpróitéiní a bhaineann le comhleá gaiméití.Tabharfaidh ár móilín athchuingreach saintréith de chuid SPACA6 agus a struchtúr réitithe léargas ar na caidrimh idir na struchtúir chomhroinnte seo agus a ról i gceangal agus comhleá gaiméití.
Optamaíodh an t-ord DNA a fhreagraíonn don ectodomain SPACA6 daonna tuartha (uimhir aontachais NCBI NP_001303901.1; iarmhair 27–246) le haghaidh cur in iúl i gcealla Drosophila melanogaster S2 agus sintéisíodh é mar bhlúire géine leis an seicheamh a ionchódaíonn Kozak (Eurofins Genomics)., an comhartha secretion BiP agus na foircinn comhfhreagracha 5′ agus 3′ do chlónáil ligation-neamhspleách den ghéin seo isteach i veicteoir slonn pMT bunaithe ar thionscnóir metallothionein arna mhodhnú lena roghnú le puromycin (pMT-puro).Ionchódaíonn an veicteoir pMT-puro suíomh scoilteachta thrombin agus ina dhiaidh sin clib C-críochfort 10x-A (Fíor S2).
Rinneadh aistriú cobhsaí an veicteora SPACA6 pMT-puro isteach i gcealla D. melanogaster S2 (Gibco) mar an gcéanna leis an bprótacal a úsáideadh do IZUMO1 agus JUNO43.Leáigh agus fásadh cealla S2 i meán Schneider (Gibco) agus forlíonta le tiúchan deiridh de 10% (v/v) séiream lao féatais teas-dhíghníomhaithe (Gibco) agus antaibheathach frithmhiocótach 1X (Gibco).Plátáladh cealla pasáiste luath (3.0 x 106 cealla) i toibreacha aonair de phlátaí 6-tobair (Corning).Tar éis 24 uair an chloig goir ag 27 ° C, aistríodh cealla le meascán de 2 mg den veicteoir SPACA6 pMT-puro agus imoibrí aistrithe Effectene (Qiagen) de réir phrótacal an mhonaróra.Goradh cealla tras-aistrithe ar feadh 72 uair agus ansin baineadh iad le 6 mg/ml puromycin.Rinneadh cealla ansin a leithlisiú ó mheán iomlán Schneider agus a chur i meán insect-XPRESS serum saor in aisce (Lonza) le haghaidh táirgeadh próitéin ar scála mór.Fásadh baisc 1 L de chultúr cille S2 go cealla 8–10 × 106 ml-1 i bhfleascán polapróipiléine Erlenmeyer polapróipiléine cothrom-aeráilte 2 L agus ansin steiriliú le tiúchan deiridh de 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) agus scagtha steiriúil.spreagtha.Goradh na cultúir spreagtha ag 27 ° C. ag 120 rpm ar feadh ceithre lá.
Rinneadh meán coinníollaithe ina raibh SPACA6 a leithlisiú trí lártheifneoiriú ag 5660 × g ag 4 ° C agus córas scagacháin sreabhadh tadhlaíoch Centramate (Pall Corp) ina dhiaidh sin le membrane MWCO 10 kDa.Cuir meán tiubhaithe ina bhfuil SPACA6 i bhfeidhm ar cholún 2 ml de roisín agaróis Ni-NTA (Qiagen).Nitear an roisín Ni-NTA le 10 n-imleabhar colún (CV) de mhaolán A agus ansin cuireadh 1 CV de mhaolán A leis chun tiúchan imidazole deiridh de 50 mM a thabhairt.Fuaraíodh SPACA6 le 10 ml de mhaolán A arna fhorlíonadh le imidazole go tiúchan deiridh de 500 mM.Cuireadh thrombin aicme srianta (Millipore Sigma) go díreach leis an bhfeadán scagdhealaithe (MWCO 12-14 kDa) ag 1 aonad in aghaidh an mg SPACA6 vs 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 agus 150 mM NaCl (maolán B) le haghaidh scagdhealaithe.) ag 4°C ar feadh 48 uair an chloig.Ansin caolaíodh an SPACA6 a scoilteadh le thrombin faoi thrí chun an tiúchan salainn a laghdú agus a luchtú ar cholún malartaithe 1 ml MonoS 5/50 GL (Cytiva/GE) cothrom le 10 mM Tris-HCl, pH 7.5.Niteadh an malartóir caitiúcháin le 3 CV de 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, ansin rinneadh SPACA6 a mhaolú le grádán líneach de 0 go 500 mM NaCl i 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 do 25 CV.Tar éis crómatagrafaíocht malairte ian, díríodh SPACA6 go 1 ml agus baineadh é go isocratach ó cholún ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) atá cothrom le maolán B. De réir an chrómatagram, codáin linne agus comhchruinnithe ina bhfuil SPACA6.Bhí an íonacht á rialú ag leictreafóiréis dhaite Coomassie ar fhoirmiú 16% SDS-polyacrylamide.Rinneadh tiúchan próitéine a chainníochtú trí ionsúiteacht ag 280 nm ag baint úsáide as an dlí Beer-Lambert agus an comhéifeacht díothaithe molar teoiriciúil.
Scagdhealaíodh SPACA6 íonaithe thar oíche i gcoinne fosfáit sóidiam 10 mM, pH 7.4 agus 150 mM NaF agus caolaíodh é go 0.16 mg/mL roimh anailís trí speictreascópacht CD.Bailíodh scanadh speictreach ar dhlúthdhioscaí le tonnfhad 185 go 260 nm ar speictropolariméadar Jasco J-1500 ag baint úsáide as cuvettes Grianchloch le fad cosáin optúla 1 mm (Helma) ag 25 ° C ag ráta 50 nm/nóim.Ceartaíodh bunlíne na speictrim CD, meánaíodh os cionn 10 n-éadáil, agus aistríodh go meán-éilipseacht iarmharach (θMRE) i gcéimeanna cm2/dmol:
áit arb é MW meáchan móilíneach gach sampla in Da;Is é N líon na n-aimínaigéad;θ is é an éilipseacht i millidegrees;d comhfhreagraíonn do fhad an chosáin optúil ina cm;tiúchan próitéine in aonaid.